TRIF在秋水仙素致小鼠紋狀體-黑質軸突退變模型中的作用*

周紅利，林 森，李淑蓉，孫 靜，蘇炳銀△

1.成都醫學院 (成都 610500)；2.成都醫學院 發育與再生四川省重點實驗室 (成都 610500)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類天然免疫受體，介導神經退行性疾病的炎性反應[1]。在中樞神經系統中，TLRs主要表達于具有免疫功能的膠質細胞中，如小膠質細胞。TLRs種類較多，不同配體介導信號通路具有不同生物學效應，其信號傳導通路根據其是否依賴髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)，可分為MyD88依賴型和MyD88非依賴型兩種途徑[2-3]。MyD88是大多數TLRs信號轉導中的接頭分子，TLR3和TLR4是非MyD88依賴的β-干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing INF-β, TRIF)信號途經，介導釋放細胞因子、趨化因子和轉錄因子，參與神經免疫炎癥反應[4-5]。研究[6]證明，TRIF突變鼠表現為TLR3/4炎癥反應缺陷。而TRIF過表達則可引起293細胞NF-κB和IFN-β啟動子激活。研究[7-8]發現，中腦黑質部位多巴胺(dopamine,DA)神經元對微管解聚劑敏感，微管系統在DA 神經元存活中有重要作用。本課題利用微管解聚劑秋水仙素(colchicine,COL)構建軸突退變模型，使用TRIF敲除小鼠研究TRIF基因在黑質神經元退變過程中的作用，初步探討在神經元退變過程中，TRIF對DA神經元及其軸突的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取TRIF基因敲除小鼠(TRIF小鼠)為實驗組，由第三軍醫大學新橋醫院楊清武教授贈予。具有相同遺傳背景的C57BL/6小鼠(WT小鼠)為對照組。每組5只，雄性， 8～12 周齡，體重22～24 g。兩組小鼠均使用COL藥物構建小鼠紋狀體-黑質軸突退變模型，小鼠生活于正常的 12 h光暗環境中，并能夠得到充分食物和水。

1.2 主要實驗試劑及設備

COL(Sigma，美國)；DA、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)及 二羥苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)標準品(Sigma，美國)；高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀(Alliance-2695，美國)；勻漿機(北京市科學器材公司)；臺式高速冷凍離心機(Eppendorf 5810R，德國)；腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)；曠場實驗系統(上海軟隆技發展有限公司);轉棒儀(四川成都泰盟科技有限公司)。

1.3 構建軸突退變模型

采用立體定位微量注射，使用腦立體定位儀，在紋狀體部位注射1 μL體積的COL(濃度1 g/L)制備模型。具體方法如下：用4%水合氯醛麻醉小鼠，剔除頭部皮膚，將小鼠門牙固定在門齒固定器上，并用耳棒將頭部兩側耳蝸固定好；皮膚消毒后，用手術刀切開顱蓋皮膚，用3%雙氧水輕輕磨損皮下組織，暴露前囟；以前囟為標點，向前0.8 mm，左側旁開2 mm，進針深度為3.5 mm，緩慢注射；注射完畢后，留針5 min，最后消毒縫合皮膚。建模后隨時觀察，選擇無感染小鼠進行后續實驗。

1.4 行為學檢測

1.4.1 一般行為學變化 在構建小鼠紋狀體-黑質軸突退變模型過程中，注意觀察各組小鼠是否出現震顫、肌肉僵直、轉圈、運動遲緩等行為學方面的變化。

1.4.2 監測體重變化 在制備模型1、3、7、14 d后，用體重秤對兩組小鼠體重進行檢測，觀察同時間點兩組小鼠術后體重變化。

1.4.3 曠場實驗 曠場實驗是一項經典的評價嚙齒類實驗動物運動功能的行為學檢測方法,已被廣泛運用于神經行為學的基礎研究[9-10]。本實驗拿取小鼠放進曠場反應箱時，溫柔輕放，記錄小鼠活動時間5 min， 主要觀察小鼠的自發活動行為。每次檢測完，用酒精消毒擦洗干凈。

1.4.4 轉棒耐力檢測 轉棒實驗設定轉速為30 r/min，記錄好小鼠能轉棒的時間。每次檢測5 min，在同1個時間點每只小鼠連續測3次，最后取平均值。

1.4.5 游泳狀態檢測 提起小鼠尾部，輕柔地放進游泳池，保持水溫(25±2)°C，觀察小鼠在1 min內游泳的方向及速度。待小鼠全部檢測完及時更換籠子墊料。

1.5 HPLC檢測

建模1、3、7、14 d 后，每組各取2只小鼠，直接將其斷頭處死。迅速取出全腦組織置于冰臺上，快速分離紋狀體，濾紙吸干后精確稱重。將待測標本放入已加3倍量蛋白沉淀劑的離心管內，在冰浴上用攪拌器將組織塊研成勻漿。靜置30 min后，在4 ℃，離心速度12 000 r/min，離心半徑10 cm條件下，離心10 min，取上清獲紋狀體勻漿后樣本。蛋白沉淀劑制備、對照品儲備條件及色譜條件均參照文獻[ 11 ]進行，測定該模型4個時間點紋狀體損傷側中神經遞質DA、DOPAC和5-HT等含量變化。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 兩組小鼠建模后基本情況

在紋狀體部位給予COL后，兩組小鼠均表現為震顫、行動緩慢、打轉、弓背等行為，提示軸突退變模型制備成功。實驗組小鼠的靜止性震顫、步態不穩較對照組更為明顯。建模3 d后兩組小鼠均有明顯偏向運動(向損傷側運動)(圖1)。

圖1 給藥3 d后兩組小鼠偏向運動狀態

2.2 不同時間點兩組小鼠體重的比較

組別與不同時間點的交互作用差異無統計學意義(F=0.170，P=0.916)。兩組小鼠組間體重比較，差異有統計學意義(F=43.942，P<0.001)，兩組小鼠組間體重比較不同時間點差異有統計學意義(F=63.426，P<0.001)(表1、圖2)。

表1 不同時間點兩組小鼠體重比較

圖2 兩組小鼠體重隨時間變化誤差折線圖

2.3 不同時間點兩組小鼠1 min內游泳里程比較

組別與不同時間點的交互作用差異有統計學意義(F=3.200，P=0.041)。兩組小鼠組間1 min內游泳里程組間比較，差異有統計學意義(F=9.973，P=0.013)；兩組小鼠組間1 min內游泳里程比較不同時間點差異有統計學意義(F=5.596，P=0.005)(表2、圖3)。

圖3 兩組小鼠1 min內游泳里程隨時間變化誤差折線圖

表2 不同時間點兩組小鼠1 min內游泳里程比較

2.4 不同時間點兩組小鼠5 min內曠場活動里程比較

組別與不同時間點的交互作用無統計學意義(F=0.304，P=0.822)。兩組小鼠5 min內曠場活動里程組間比較，差異無統計學意義(F=4.533，P=0.066)，兩組小鼠組間5 min內曠場活動里程比較不同時間點有差異(F=21.790，P<0.001)(表3、圖4)。

圖4 兩組小鼠5 min內曠場活動里程隨時間變化誤差折線圖

表3 不同時間點兩組小鼠5 min內曠場活動里程比較

2.5 不同時間點兩組小鼠轉棒時間比較

組別與不同時間點的交互作用無統計學意義(F=0.496，P=0.689)。兩組小鼠轉棒時間組間比較，差異無統計學意義(F=1.828，P=0.213)，不同時間點兩組小鼠組間轉棒時間比較，差異有統計學意義(F=6.252，P=0.003)(表4、圖5)。

表4 不同時間點兩組小鼠轉棒時間比較

圖5 兩組小鼠轉棒時間隨時間變化誤差折線圖

2.6 不同時間點兩組小鼠紋狀體中神經遞質含量比較

HPLC檢測結果證實，軸突退變模型建立1、3、7 d后實驗組小鼠的紋狀體神經遞質DA及DOPAC含量低于對照組小鼠(P<0.05)，提示DA神經元退行病變加重。而建模后14 d后兩組的紋狀體神經遞質含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 HPLC檢測兩組小鼠制備模型1、3、7、14 d后紋狀體神經遞質含量變化

注：與實驗組比較，*P<0.05

3 討論

天然免疫受體不僅參與抵御外來病原體的免疫反應，而且參與神經免疫活動。TLR是一類天然免疫受體，中樞神經系統中，TLRs主要表達于小膠質細胞和巨噬細胞。大部分TLR通過MyD88依賴途經轉導信號，主要引發小膠質細胞過度激活，產生炎癥效應失控。TLR3和TLR4下游還存在另一種非MyD88依賴的TRIF信號途經，最終激活NF-κB 和IRF3，介導釋放細胞因子、趨化因子和轉錄因子[12]。楊明[13]在研究中發現，TLR3/TRIF信號通路的激活可以促進小鼠帕金森模型腦內小膠質細胞活化，并且該信號通路的激活有利于腦內的炎癥微環境向抗炎趨勢轉變。Packard 等[14]研究證實，通過TLR3的特異性配體PolyI∶C適度預刺激機體，能夠一定程度上保護腦缺血引起的腦損傷。還有研究[15]證實，TLR2/6協同作用和TLR9激活作用能夠保護感染了H3N2、H1N1的小鼠，使其免受致命性流感威脅。這些研究表明，TLR信號系統對中樞神經系統具有保護作用，TLR誘導小膠質細胞適度活化，可分泌多種神經營養因子，還可釋放一些信號分子調控和減輕過度炎癥反應。

微管系統是DA神經元存活的必備要素。已有研究[7-8]證實，紋狀體內注射COL可以誘發黑質部位 DA 神經元變性以及黑質-紋狀體通路逆行變性，觀察DA軸突末梢微管系統對DA神經元存活的影響，并證明了 COL 能直接活化小膠質細胞和星形膠質細胞。本研究也采用COL 構建了小鼠紋狀體-黑質軸突退變模型，兩組小鼠均出現震顫、同側轉動、運動緩慢等癥狀，并且在給藥后3 d 癥狀嚴重，小鼠體重較輕，在術的14 d小鼠體重逐漸升高，運動能力逐漸在恢復，說明小鼠DA神經元變性軸突退變后小鼠機體啟動代償功能，這與梁亞杰[8]制備的模型一致。同時，本實驗進一步觀察了TRIF在COL構建的小鼠紋狀體-黑質軸突退變模型中炎癥反應的作用。兩組小鼠組間游泳路程及體重比較，差異有統計學意義(P<0.05)。HPLC檢測結果顯示，實驗組小鼠腦部紋狀體DA和DOPAC在1、3、7 d明顯高于同時間段對照組(P<0.05)，該結果初步提示TRIF在紋狀體-黑質軸突退變模型前期與MyD88引發的炎癥損傷和神經毒作用形成拮抗作用。

綜上所述，TRIF敲除小鼠軸突退變模型中DA神經元分泌DA及DOPAC明顯低于WT小鼠，提示敲除TRIF基因能夠加重軸突退變引發的DA神經元損傷，該損傷引發動物肢體運動功能受損，初步表明TRIF在正常機體中可能對神經元的遞質水平有維持功能，并在軸突退變過程中具有保護功能，為認識天然免疫受體調控機制增加新內容。但本實驗由于TRIF小鼠繁殖受限，每組小鼠的行為學檢測分析統計樣本較少，后期將擴大樣本進一步做形態學及分子學水平多方面實驗加以驗證這一結論。