鮑曼不動桿菌耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族外排泵基因?qū)δ退幮缘挠绊?

劉獻(xiàn)清，藺 飛，彭 勤，王清會，凌保東△

1.成都醫(yī)學(xué)院 結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥劑科 (成都 610500)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種廣泛存在于自然環(huán)境中的兼性厭氧、非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，可致呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，泌尿道、傷口、血液等感染，有較高的發(fā)病率與死亡率[1-2]。近年來，抗菌藥物使用更加頻繁，鮑曼不動桿菌的多重耐藥菌株、泛耐藥株在臨床感染中越來越常見[3]。2017年2月，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布了首份抗生素耐藥“重點(diǎn)病原體”清單，其中碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌為緊急項(xiàng)之一[4]。

耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族(resistance-nodulation-cell-division family, RND)外排泵能將多種抗菌藥物泵出細(xì)胞外，與臨床菌株多重耐藥結(jié)果密切相關(guān)[5-6]。本研究采用自殺性載體pMo130-Telr，通過同源重組的方法對標(biāo)準(zhǔn)耐藥鮑曼不動桿菌AYE的主要RND外排泵基因：adeB、adeB-like、adeFGH、adeIJK分別進(jìn)行敲除，對比檢測敲除前后菌株抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)，探討RND外排泵對鮑曼不動桿菌耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

鮑曼不動桿菌AYE和 ATCC19606購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(American type culture collection, ATCC)。質(zhì)控菌株(大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853)由實(shí)驗(yàn)室前期保存。

1.2 材料與試劑

引物合成及測序(成都擎科)；核酸染料4s Red Plus(上海生工)；2 × Taq Master Mix (Dye Plus)(南京諾唯贊)；PrimeStar HS DNA Polymerase(Takara)；DNA Marker(成都福際)；限制性內(nèi)切酶及T4連接酶(Thermo)；慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮、舒巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、阿米卡星、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、替加環(huán)素購自大連美侖，氨芐西林、卡那霉素、環(huán)丙沙星、亞碲酸鉀、蔗糖購自上海生工；酵母提取物及胰蛋白胨(OXOID)；水解酪蛋白(Mueller-Hinton, MH)瓊脂培養(yǎng)基及陽離子調(diào)節(jié)肉湯(cationadjusted Mueller-Hinton broth, CAMHB)培養(yǎng)基購自青島海博。

1.3 儀器

恒溫培養(yǎng)箱(中國一恒科學(xué)儀器)；生物安全柜、恒溫?fù)u床(Thermo)；PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf)；核酸水平電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad)；多點(diǎn)接種儀(日本佐久間)等。

1.4 基因敲除步驟及方法

1.4.1 菌株鑒定及質(zhì)控 AYE的鑒定引物如下(表1)。

表1 AYE鑒定引物

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)過程主要參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，具體步驟如下：1)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：通過NCBI數(shù)據(jù)庫資料確定AYE的RND外排泵基因adeB、adeB-like、adeFGH、adeIJK，并進(jìn)行相關(guān)引物的設(shè)計。使用引物如下(表2)。2)載體構(gòu)建：以敲除adeB基因?yàn)槔孩偻ㄟ^PCR法構(gòu)建敲除基因的上下游同源序列并以重疊PCR鏈接；②將上下游鏈接序列以Not1和BamH1進(jìn)行雙酶切后插入自殺性載體pMo130-Telr；③構(gòu)建載體的篩選及鑒定：a.引物PCR鑒定；b.雙酶切鑒定：構(gòu)建成功載體，電泳可見兩條帶：一條較小條帶約2 000 bp(鏈接片段)，一條較大條帶約9 000～10 000 bp(線性質(zhì)粒片段)；c.PCR及雙酶切鑒定后質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，取無突變的質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。載體構(gòu)建基本流程如下(圖1)。3)基因敲除步驟：以敲除adeB基因?yàn)槔孩俳雍希簩y帶自殺性載體的47055菌株與敲除目的菌株AYE的菌液混合濃集于NC膜上，37 ℃培養(yǎng)6～8 h后篩選：取接合后的稀釋菌液涂布于T+G(亞碲酸鉀30 mg/L+慶大霉素16 mg/L)固體培養(yǎng)板上，待長出單菌落后以引物AYEAdeB1上-FNot1/AYEAdeB1下-RBamH1，p130-F/p130-R及AYE鑒定引物進(jìn)行鑒定。②第2步篩選：以含10%蔗糖的YT液體養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基中包括10 g胰蛋白胨+10 g酵母提取物)傳代培養(yǎng)，含10% 蔗糖的YT固體培養(yǎng)基分離單菌落。挑單菌落分別于LB固體培養(yǎng)基板和T板(亞碲酸鉀30 mg/L)劃線，37 ℃培養(yǎng)。選在LB固體培養(yǎng)板上長而在T板上不長的單菌落，以引物AYEAdeB1上-FNot1/AYEAdeB1下-RBamH1，p130-F/p130-R，AYEAdeB1檢F/AYEAdeB1檢R及AYE鑒定引物進(jìn)行鑒定。③對PCR鑒定成功的菌株進(jìn)行測序，檢驗(yàn)基因敲除準(zhǔn)確性。基因敲除的基本流程如下(圖2)。

表2 用于基因敲除的PCR和DNA測序引物

圖1 載體構(gòu)建的基本流程圖

圖2 敲除的基本流程圖

1.5 MIC方法

根據(jù)2017年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(clinical and laboratory standards institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)對基因敲除前后菌株采用瓊脂50%稀釋法或微量肉湯法進(jìn)行MIC檢測。結(jié)果判讀根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)及2017年CLSI標(biāo)準(zhǔn)。替加環(huán)素與多粘菌素E采用微量肉湯法，其余藥物采用瓊脂50%稀釋法。

2 結(jié)果

2.1 外排泵基因敲除株AYE△adeB、AYE△adeB-like鑒定結(jié)果

與野生株對比，敲除株檢測不到該基因，而AYE野生株可以檢測到對應(yīng)基因(1、5對比及13、17對比)。以敲除基因的上游同源序列F/下游同源序R(AYEAdeB1上-FNot1AYEAdeB1下-RBamH1、AYEAdeB2上-FNot1/AYEAdeB2下-RBamH1)檢測時，敲除株檢測產(chǎn)物比AYE野生株檢測產(chǎn)物小約3 000 bp(2、6對比及14、19對比)。引物Csy1-F/Csy2-R使用以確保菌株都為AYE(3、7、15、18)。引物p130-F/p130-R使用以確保第2次篩選后載體pMo130-Telr徹底從AYE中丟失(4、8、16、20)。其余泳道未檢測PCR產(chǎn)物(圖3)。

圖3 外排泵基因adeB、adeB-like敲除結(jié)果圖

注：M：DNA Marker；1～8：adeB敲除結(jié)果鑒定，其中1～4為AYE△adeB結(jié)果，5～8為AYE結(jié)果；1、5：使用引物AYEAdeB1檢F/AYEAdeB1檢R，AYE△adeB檢測不到產(chǎn)物，AYE產(chǎn)物約400 bp；2、6：使用引物AYEAdeB1上-FNot1/AYEAdeB1-RBamH1，AYE△adeB產(chǎn)物約2 000 bp，AYE產(chǎn)物>5 000 bp；13～20：adeB-like敲除結(jié)果鑒定，其中13～16為AYE△adeB-like結(jié)果，17～20為AYE結(jié)果；13、17：使用引物AYEAdeB2檢F/AYEAdeB2檢R，AYE△adeB-like檢測不到產(chǎn)物，AYE產(chǎn)物約700 bp；14、19：使用引物AYEAdeB2上-FNot1/AYEAdeB2-RBamH1，AYE△adeB-like產(chǎn)物約2 000 bp，AYE產(chǎn)物>5 000 bp；3、7、15、18：使用引物Csy1-F/Csy2-R以確保菌株來源AYE，產(chǎn)物約1 200 bp；4、8、16、20：使用引物p130-F/p130-R以確保第2次篩選后載體pMo130-Telr徹底從AYE中丟失，檢測不到產(chǎn)物。其余泳道未檢測PCR產(chǎn)物

2.2 外排泵基因敲除株AYE△adeFGH、AYE△adeIJK鑒定結(jié)果

與野生株對比，AYE△AdeFGH檢測不到該基因，而野生株可以檢測到對應(yīng)基因(1、5對比)；AYE△AdeIJK相較于AYE野生菌株檢測到的產(chǎn)物小約3 400 bp(13、17對比)。以敲除基因的上游同源序列F/下游同源序列R[AdeG上(Not1)F/AdeG下(SphⅠ)R、AdeJ上PstIF/AdeJ下SphⅠR]檢測時，AYE△AdeFGH檢測產(chǎn)物較AYE野生株檢測產(chǎn)物小約5 500 bp(2、6對比)，AYE△AdeIJK檢測產(chǎn)物較AYE野生株檢測產(chǎn)物小約3 300 bp(14、18對比)。引物Csy1-F/Csy2-R使用以確保菌株都為AYE(3、7、15、19)。引物p130-F/p130-R使用以確保第2次篩選后載體pMo130-Telr徹底從AYE中丟失(4、8、16、20)。其余泳道未檢測PCR產(chǎn)物(圖4)。

圖4 外排泵基因adeFGH、adeIJK敲除結(jié)果圖

注：M：DNA Marker；1～8：adeFGH敲除結(jié)果鑒定，其中1～4為AYE△adeFGH結(jié)果，5～8為AYE結(jié)果；1、5：使用引物AdeGRTF/AdeGRTR，AYE△adeFGH檢測不到產(chǎn)物，AYE產(chǎn)物約260 bp；2、6：使用引物AdeG上(Not1)F/AdeG下(SphⅠ)R，AYE△adeFGH產(chǎn)物約2 000 bp，AYE產(chǎn)物約7 500 bp；13～20：adeIJK敲除結(jié)果鑒定，其中13～16為AYE△adeIJK結(jié)果，17～20為AYE結(jié)果；13、17：使用引物AdeJF/AdeKR，AYE△adeIJK檢測不到產(chǎn)物，AYE產(chǎn)物約260 bp；14、19：使用引物AdeJ上PstIF/AdeJ下SphIR，AYE△adeIJK產(chǎn)物約2 000 bp，AYE產(chǎn)物約5 300 bp；3、7、15、18：使用引物Csy1-F/Csy2-R以確保菌株來源AYE，產(chǎn)物約1 200 bp；4、8、16、20：使用引物p130-F/p130-R，以確保第2次篩選后載體pMo130-Telr徹底從AYE中丟失，檢測不到產(chǎn)物。其余泳道未檢測PCR產(chǎn)物

2.3 MIC結(jié)果

實(shí)驗(yàn)檢測了AYE及其RND相關(guān)外排泵基因敲除菌株對17種抗菌藥物的MIC值，結(jié)果顯示，敲除RND外排泵相關(guān)基因后，抗菌藥物的MIC值呈現(xiàn)不同程度降低。1)對AYE△adeB，MIC值降低到原MIC的1/4或更低的抗菌藥物有：亞胺培南、舒巴坦、氨芐西林舒巴坦、頭孢西丁、阿米卡星、卡那霉素、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、替加環(huán)素；MIC值降低到原MIC的1/2的抗菌藥物有：美羅培南、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢他啶、左氧氟沙星、多粘菌素E。2)對AYE△adeB-like，MIC值降低到原MIC的1/2的抗菌藥物有：美羅培南、氨芐西林、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、多粘菌素E。3)對AYE△adeIJK，MIC值降低到原MIC的1/2的抗菌藥物有：美羅培南、氨芐西林、左氧氟沙星。4)對AYE△adeFGH，MIC值降低到原MIC的1/2的抗菌藥物只有多粘菌素E。其中adeB敲除后MIC值變化最明顯，具體結(jié)果如下(表3)。

表3 AYE RND外排泵基因敲除前后菌株的MIC(mg/L)

3 討論

外排泵作為細(xì)菌主要耐藥機(jī)制之一，在鮑曼不動桿菌中普遍存在，且大多數(shù)的分離株至少表達(dá)一種RND型外排泵[8]。RND外排泵系統(tǒng)涉及多種功能，包括細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、毒力因子和有毒化合物的排出[9]，具有廣泛的作用底物，包括抗菌藥物和防腐劑等[8]。越來越多的證據(jù)[6,10]顯示，RND外排泵系統(tǒng)的過度表達(dá)與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)。本研究對鮑曼不動桿菌AYE的RND外排泵基因敲除前后菌株進(jìn)行了17種抗菌藥物的MIC檢測，結(jié)果顯示：adeB的缺失，具有最廣泛抗菌藥物的藥敏結(jié)果改變，增強(qiáng)AYE對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、替加環(huán)素及多粘菌素E的的敏感性；adeIJK的缺失，增強(qiáng)AYE對美羅培南、氨芐西林、頭孢西丁、左氧氟沙星、四環(huán)素類、替加環(huán)素及多粘菌素E的敏感性，而對氨基糖苷類抗菌藥物和環(huán)丙沙星的敏感性無影響，與Coyne等[8,11]文獻(xiàn)內(nèi)容相符。adeB-like的缺失，增強(qiáng)AYE對美羅培南、氨芐西林、頭孢西丁、喹諾酮類、四環(huán)素類、替加環(huán)素及多粘菌素E的敏感性；adeFGH的缺失，僅增強(qiáng)了AYE對多粘菌素E的敏感性，證實(shí)了adeFGH的缺失不影響菌株對氨基糖苷類及β-內(nèi)酰胺類的耐藥性，且對抗菌藥物敏感性的影響最小[10]。

綜上所述，不同的RND外排泵基因的缺失對鮑曼不動桿菌耐藥性具有不同程度影響，其中adeB對鮑曼不動桿菌AYE的耐藥結(jié)果影響最明顯。鮑曼不動桿菌AYE菌株與 RND外排泵基因敲除菌株對比，對多種抗菌藥物藥敏結(jié)果的改變，進(jìn)一步證實(shí)了RND外排泵在鮑曼不動桿菌耐藥中的重要作用。