刺參“腐皮綜合征”拮抗菌CN101 發酵條件的優化

■王 穎 李雅華 咸洪泉

（青島農業大學生命科學學院 農業微生物實驗室，山東青島266109）

刺參“腐皮綜合征”是一種重要的刺參病害[1-2]。該病具有發病急、發病率高和死亡率高的特點。幼參和成參均可被感染，其中幼參的發病率和死亡率均明顯高于成參，死亡率高達90%以上[3]。將“腐皮綜合征”拮抗菌制成微生態制劑應用是一種有效的刺參“腐皮綜合征”防控手段。而微生態制劑的開發必須首先解決拮抗菌發酵培養的問題，因為不同的拮抗菌菌種所適宜的培養發酵條件不同，因此研究優化“腐皮綜合征”拮抗菌高效發酵條件，對刺參“腐皮綜合征”病害的防控具有重要意義，可為拮抗菌微生態制劑的開發和微生物發酵飼料的研制奠定基礎，為將來拮抗菌微生態制劑和微生物發酵飼料的應用提供科學依據。

刺參“腐皮綜合征”是由海水中的燦爛弧菌、假交替單胞菌等病原菌侵入、感染引起的一種刺參重要病害[4]。目前用于防治刺參病害的方法主要有使用抗生素[5]、免疫增強劑[6]、微生態制劑[7]等。抗生素的使用不僅造成了環境的污染，也使細菌產生了抗性，為控制抗性細菌需進一步增加抗生素的投放量[8]，形成了惡性循環。免疫增強劑是通過添加一些多糖[9]（如殼聚糖、海藻硫酸多糖等）或植物源物質(如黨參[10]、甘草酸[11]等)對刺參腸道組織消化酶、蛋白酶等的影響，增強刺參自身的免疫力，從而達到防病的目的。微生態制劑是可直接使用的活菌制劑，制劑中的有益微生物不但可以改善水質，可能還含有其它活性物質，能夠幫助刺參的傷口愈合，并能夠抑制致病的病原菌感染，具有防治病害發生的作用[12]。有益微生物的使用是刺參“腐皮綜合征”病害防控的重要措施和發展趨勢。

拮抗菌CN101 是本實驗室篩選的對病原菌燦爛弧菌和假交替單胞菌有強拮抗作用、應用安全的一株芽孢桿菌[13]，對刺參“腐皮綜合征”有良好的防治效果，可用于微生態制劑的開發和微生物發酵飼料的研制，以防治刺參“腐皮綜合征”病害。而將該菌株用于制備微生物飼料添加劑的基礎和關鍵是明確拮抗菌CN101的最適發酵條件，以便于實現拮抗菌CN101的大規模發酵培養。因此，本研究在實驗室前期研究的基礎上，對拮抗菌CN101 的生產發酵條件進行探究，為防控刺參“腐皮綜合征”病害和微生物飼料添加劑的研制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拮抗菌CN101（Bacillus.sp），分離自刺參養殖池底泥，由青島農業大學農業應用微生物實驗室保存。

1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0。

BS 培養基：參考張璐等的發酵培養基[14]，乳糖20 g、牛肉膏15 g、K2HPO3·3H2O 0.75 g、MgSO40.75 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

Luo 培養基：參考駱藝文的優化培養基[7]，葡萄糖10 g、豆餅粉10 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值7.5。

2116 培養基：酵母粉1 g、蛋白胨5 g、人工海水1 000 ml，pH值7.5。

人工海水配方：NaCl 28.15 g、MgSO4·7H2O 6.92 g、MgCl2·6H2O 5.51 g、CaCl2·7H2O 0.3 g、KCl 0.67 g、蒸餾水定容至1 000 ml。

li 培 養 基：MgSO4·7H2O 0.2 g、NaH2PO41 g、Na2HPO41 g、葡萄糖10 g、NaCl 5 g、MnSO40.48 g、豆餅粉2 g、玉米粉2 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0。

1.3 種子液的制備

拮抗菌CN101平板劃線至LB固體培養基，挑單菌落接種至100 ml LB 液體培養基中，28 ℃、140 r/min搖床培養24 h，備用。

1.4 細菌數量測定方法

拮抗菌細菌數量以OD600值的大小表示，利用752型紫外可見光分光光度計采用比濁法進行測定。以滅菌的相應培養基調零，將培養一定時間的發酵液樣品用滅菌的相應培養基稀釋至OD600值的大小在0.2～0.8 之間，測定稀釋樣品的OD600值。細菌生物量=稀釋樣品的OD600值×樣品的稀釋倍數。

1.5 培養基優化

1.5.1 基礎培養基的篩選

將種子液以1%的比例接種到裝有100 ml不同培養基的250 ml 三角瓶中，28 ℃、140 r/min 培養，每24 h取樣測定OD600值一次，測至72 h，三次重復。

1.5.2 培養基成分優化

碳源優化，分別用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉等量替換乳糖作為基礎培養基的碳源，其它組分不變，測定不同碳源對拮抗菌數量的影響。

氮源優化，分別用豆餅粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、KNO3、NH4NO3作為氮源等量替換牛肉膏，其它組分不變，測定不同氮源對拮抗菌數量的影響。

無機鹽優化，分別用A組MgSO4+MnSO4+K2HPO4、B 組MgSO4+MnSO4+NaCl、C 組K2HPO4+MnSO4+NaCl、D 組K2HPO4+MgSO4、E 組K2HPO4+MgSO4+ NaCl、F 組K2HPO4+MnSO4組合作為無機鹽（總量均為1.5 g/l，各組分之間的比例為1:1），其它組分不變，測定不同無機鹽組合對拮抗菌數量的影響。

正交試驗：用Spss 20進行三因素三水平L9（34）正交試驗設計(見表1），確定一組最優培養基配方。

1.6 發酵條件優化

溫度對發酵的影響，將種子液接種到裝有100 ml培養基的250 ml 三角瓶中，分別置于15、20、25、30、35 ℃全溫振蕩培養箱中，140 r/min 振蕩培養，每24 h測定一次細菌數量，測至72 h；三次重復。

表1 正交試驗設計(g/l)

初始pH 值對發酵的影響，分別調節優化培養基的初始pH值為6、7、7.5、8、9，在25 ℃、140 r/min 條件下振蕩培養，檢測不同pH值和培養時間的細菌數量；三次重復。

接種量對發酵的影響，分別按照1%、3%、5%、7%、9%的接種量，將種子液接種到裝有100 ml 優化培養基的250 ml三角瓶中，在25 ℃、140 r/min條件下振蕩培養，檢測不同接種量和培養時間的細菌數量；三次重復。

裝瓶量對發酵的影響，250 ml三角瓶中分別裝入25、50、75、100、125 ml的優化培養基，以1%的接種量接種種子液，在25 ℃、140 r/min 條件下振蕩培養，檢測不同裝瓶量和培養時間的細菌數量；三次重復。

1.7 分析方法

試驗數據用GraphPad Prism7.00軟件進行統計和方差分析。方差分析采用顯著水平為P＜0.05 的多重比較檢驗法。

2 結果

2.1 培養基成分優化結果

2.1.1 基礎發酵培養基的篩選

本研究在前期研究的基礎上，選取5種較適宜的培養基進行基礎發酵培養基的篩選，檢測了不同培養基中拮抗菌CN101的生長情況（圖1）。

圖1 不同基礎培養基發酵對菌體生長的影響

結果顯示，24 h時BS培養基和LB培養基的培養效果均較好，且兩者之間無顯著差異；48 h和72 h時，BS培養基的培養效果明顯優于LB培養基，說明BS培養基更適于拮抗菌的培養。因此，本試驗以BS 培養基作為基礎發酵培養基進行培養基成分和發酵條件的優化。

2.1.2 培養基成分的優化

以BS 培養基為基礎培養基，測定了淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、玉米粉5 種碳源對拮抗菌生長的影響（圖2）。不同碳源對拮抗菌的生長有不同程度的影響，供試的碳源中乳糖、蔗糖、葡萄糖較有利于拮抗菌的生長，而淀粉和玉米粉不利于拮抗菌的生長；24 h時培養基中添加蔗糖的菌體數量顯著高于添加乳糖、葡萄糖；48 h 和72 h 時，培養基中添加乳糖的菌體數量顯著高于添加其他碳源的。培養基中菌體數量在24 h和48 h時蔗糖顯著高于葡萄糖，72 h時差異不顯著；說明以蔗糖為碳源有利于拮抗菌的快速生長繁殖，以乳糖為碳源有利于獲得更高的拮抗菌數量。

圖2 不同碳源發酵對菌體生長的影響

因此，綜合考慮生長速率、生物產量和原料成本的問題，進一步檢測了乳糖和蔗糖的不同配比對拮抗菌生長的影響（圖3）。結果表明以乳糖和蔗糖為復合碳源時乳糖與蔗糖比例為3:1時，拮抗菌生長速率、生物產量與以乳糖為單一碳源時無顯著性差異，但有利于降低拮抗菌發酵生產的原料成本。所以拮抗菌發酵適宜的碳源為乳糖和蔗糖組成的復合碳源，乳糖與蔗糖的比例為3:1。

以乳糖和蔗糖復合碳源作為基礎培養基的碳源，測定了不同氮源對拮抗菌生長的影響，結果表明不同氮源對拮抗菌的生長有一定影響（圖4）。有機氮源有利于拮抗菌的生長；其中在24 h和48 h時，含有機氮源豆餅粉的發酵培養基的拮抗菌菌體量最高，與其他氮源相比差異顯著。72 h 時蛋白胨作為氮源的培養基拮抗菌菌體量最高，并且顯著高于豆餅粉。為獲得較高的產量和降低成本，進一步檢測了不同配比蛋白胨和豆餅粉對拮抗菌生長的影響，結果顯示當復合氮源蛋白胨與豆餅粉比例為1:2 時，更適宜拮抗菌的生長（圖5）。

圖3 不同碳源比例發酵對菌體生長的影響

圖4 不同氮源發酵對菌體生長的影響

圖5 不同氮源比例發酵對菌體生長的影響

以優選的復合碳源、復合氮源作為基礎培養基的碳源和氮源，探討了不同無機鹽組合對拮抗菌生長的影響（見圖6）。圖6結果顯示24 h和48 h均以B組無機鹽組合MgSO4+MnSO4+ NaCl組合的菌體量最大、培養效果最好，故選擇了B組合為最佳的無機鹽組合。

圖6 不同無機鹽發酵對菌體生長的影響

培養基中復合碳源、復合氮源和復合無機鹽含量對拮抗菌生長的影響正交試驗結果見表2。由表2可知，復合氮源含量為影響CN101 生長的主要因素，復合碳源含量為次要因素，復合無機鹽含量對CN101的生長影響最小。

表2 正交試驗結果統計

發酵培養基成分優化獲得的較優培養基配方(A組)與正交試驗獲得的培養基較優培養基配方(B組)進行比較，發現其無機鹽水平不同，以此為依據設計的驗證試驗結果如圖7所示：24 h和48 h時兩處理組間差異均不顯著，即較高水平的無機鹽含量對拮抗菌的生物量影響較小；該結果也同時驗證了本研究正交試驗中獲得的培養基成分對拮抗菌生物量的影響作用的結果：復合氮源為主要影響因子，復合碳源次之，復合無機鹽的影響最小。

因此，考慮到節約生產成本，本試驗最終確定的培養基配方為：乳糖15 g、蔗糖5 g、蛋白胨2.5 g、豆餅粉5 g、MgSO40.25 g、MnSO40.25 g、NaCl 0.25 g、蒸餾水1 000 ml。

圖7 CN101正交試驗結果驗證

2.2 發酵條件的優化

溫度試驗結果（圖8）表明，拮抗菌在15～35 ℃范圍內均可生長，以25 ℃生長最快，其次是20 ℃。因此，拮抗菌的最適生長溫度為25 ℃。

圖8 不同發酵溫度對菌體生長的影響

拮抗菌在pH值6～9范圍內生長狀況良好（圖9），雖然不同初始pH值條件下拮抗菌數量差異達到顯著水平，但不同pH 值處理的OD 值差異并不大；綜合考慮拮抗菌將來應用的環境條件和馴化因素，為使拮抗菌更好的適應海參生長環境，發揮生長潛能，初始pH值以7.5為最佳。

不同的接種量對拮抗菌培養具有一定的影響（圖10），雖然培養至48 h和72 h時不同接種量處理的拮抗菌數量差異達到顯著水平，但不同接種量處理的OD 值差異并不大，因此為節約生產成本，以1%的接種量為宜。

不同的裝瓶量對拮抗菌生長的影響極大（圖11），裝瓶量越高越不利于拮抗菌的生長繁殖，說明該菌株是一株好氧菌，培養過程中應充分保障氧氣的供給量，搖瓶振蕩培養時培養基的裝液量應以10%～20%為宜。

圖9 不同初始pH值發酵對菌體生長的影響

圖10 不同接種量發酵對菌體生長的影響

圖11 不同裝瓶量發酵對菌體生長的影響

綜上所述，本試驗最終確定的發酵條件為接種量1%、裝瓶量10%～20%、溫度25 ℃、培養基初始pH 值為7.5。

將發酵條件優化前（OD600約為5）、優化后（OD600約為20～30）的結果進行對比，拮抗菌CN101 的菌體量提高了約4～6倍。

3 討論

目前微生物飼料在禽類和反芻類動物飼料中應用較廣泛，效果顯著[15]，以拮抗菌、益生菌等有益微生物開發的微生物飼料添加劑應用于刺參養殖呈現出良好的應用前景。

益生菌促進刺參生長、提高刺參抗病性一般是通過抑制病原菌、調節腸道內微生態環境、增強消化酶、蛋白酶、淀粉酶活性等改善健康狀況、刺激胃部發育和促進酶分泌等機制發揮作用[16-17]。國內外關于刺參養殖的拮抗菌研究，主要包括微生物發酵飼料[18]、免疫增強劑[6]、微生態制劑[7]等，大多數拮抗菌來源于刺參腸道內部或海洋細菌，這些拮抗菌對海水環境具有良好的適應性。

本研究通過單因素控制變量法和正交試驗，對分離自刺參養殖池底泥的拮抗菌株CN101 的發酵條件進行優化，確定了最佳的培養基配方為乳糖15 g、蔗糖5 g、蛋白胨2.5 g、豆餅粉5 g、MgSO40.25 g、MnSO40.25 g、NaCl 0.25 g。這與張璐等[14]、董春光[19]的研究不一致，可能是不同菌株對營養要素、營養水平的需求不同所致。同時，本研究結果表明無機氮源不利于CN101菌株的生長，這與曹雪梅等[20]研究的海洋細菌GM-1-1菌株相似。拮抗菌CN101在20～30 ℃、pH值7～9范圍內生長良好，而海參生長的最適pH值在7.5～8.5 之間、適宜溫度范圍為15～23 ℃[21]，說明海參生長的溫度、pH 值環境也是拮抗菌CN101 較適宜生長的條件，且拮抗菌CN101適宜生長的溫度、pH值環境條件范圍更寬；拮抗菌能夠在海參養殖環境中較好的生長繁殖，這有利于拮抗菌發揮其生防潛能。不同細菌菌株適宜的發酵條件不同[22-23]，研究不同有益細菌的最佳發酵條件是開發相應細菌菌劑的基礎。拮抗菌CN101 的最佳發酵條件為接種量1%、裝瓶量10%～20%、溫度25 ℃、初始pH值為7.5，該研究結果為拮抗菌CN101發酵培養提供了科學依據，也為利用CN101菌株研發微生物飼料添加劑奠定了基礎。

4 結論

①拮抗菌CN101的最佳發酵培養基配方為乳糖15 g、蔗糖5 g、蛋白胨5 g、豆餅粉10 g、MgSO40.25 g、MnSO40.25 g、NaCl 0.25 g、蒸餾水1 000 ml。

②拮抗菌CN101的最佳發酵條件為接種量1%、裝瓶量10%～20%、溫度25 ℃、初始pH值為7.5。