不同處理豆粕及嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬腸道微生態系統的影響

■廖 珂 賀 琴 游金明* 方 華 楊 晉 羅波文 熊 昊

（1.江西農業大學 江西省動物營養重點實驗室江西省優質安全畜禽生產產教融合重點創新中心，江西南昌330045；2.上海源耀生物股份有限公司，上海201316）

仔豬因早期斷奶引起的應激，易引發腸道微生態系統平衡失調，從而導致腸道炎癥及腹瀉的發生，嚴重甚至導致死亡[1]。微生態系統是在一定空間結構內正常微生物群以其宿主的代謝產物、組織及細胞為環境，在長期進化過程中形成的物質、能量及基因能獨立相互交換的統一生物系統[2]。腸道微生態系統有多種功能，其不僅起著維持腸道穩態，調節腸黏膜免疫的作用，還與炎癥性腸病、過敏性疾病的發生發展密切相關[3]。微生態系統的穩定，對動物抵抗腸道病原菌引起的感染性疾病極其重要。研究表明，正常益生菌群猶如一道屏障，能阻止病原菌的入侵與生長，因此具有提高免疫力，對抗疾病，預防胃腸道感染的作用。腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相制約，互相依存。當胃腸道中有益菌群占優勢時，能夠提高動物抗病能力；當有害菌群占多數時，動物抵抗力下降，誘發疾病的產生[4-5]。動物采食的飼糧不但為動物提供所需的各種營養物質，同樣也作為動物腸道內微生物的發酵底物，不同的飼糧組成會直接影響動物腸道微生物的組成結構[6]。董曉麗等[7]研究表明，添加地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌復合菌制劑可以顯著降低仔豬糞便中大腸桿菌的數量，反映了其對腸道大腸桿菌的生長和繁殖具有抑制，從而維持腸道微生態平衡。劉輝等[8]研究發現，飼糧中添加益生菌能夠有效改善生長豬的腸道微生態環境，增強機體免疫功能，提高飼糧養分表觀消化率。豆粕是仔豬日糧中的大宗蛋白質飼料資源，對豆粕進行發酵或添加有益微生物不僅可以降低抗原蛋白的活性，而且可以改善仔豬腸道微生態環境。本研究旨在探討不同處理加工的豆粕和嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬腸道微生態菌群結構的影響，研究結果將對大豆及其制品在仔豬日糧中的科學利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵豆粕、膨化大豆、嗜酸乳桿菌培養物由上海源耀生物股份有限公司提供，發酵豆粕、膨化大豆以及乳桿菌培養物的粗蛋白質含量分別為50%、35%和20%。

1.2 試驗動物和分組設計

選用遺傳背景、胎次和體重相近的21 日齡斷奶仔豬240頭，按隨機區組設計分為5個組，分別為對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組、試驗Ⅳ組，每個試驗組4個重復，每個重復12頭仔豬，公母各半。

1.3 試驗日糧和營養水平

在控制能量和粗蛋白質一致的前提下，用膨化大豆和嗜酸乳桿菌培養物來替代普通豆粕，以研究其對仔豬的影響。對照組仔豬飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧。試驗Ⅰ組仔豬飼喂發酵豆粕代替10%普通豆粕的試驗飼糧，試驗Ⅱ組仔豬飼喂用膨化大豆代替對照組飼糧中豆粕的飼糧，試驗Ⅲ組飼糧是在對照組基礎上用嗜酸乳桿菌培養物代替3%原有原料，試驗Ⅳ組飼糧是在對照組基礎上用嗜酸乳桿菌培養物代替5%原有原料，飼糧配方參照NRC（2012）和我國豬飼養標準（2004）配制，飼糧組成和營養水平見表1。

1.4 飼養管理

試驗仔豬在保育床上飼養，舍溫控制在25～28 ℃，濕度控制在55%～65%。自由采食和飲水，粉料飼喂。正試期21 d，仔豬免疫按常規程序執行。試驗第1、21 d清晨對仔豬進行空腹個體稱重，其它日常管理按常規飼養管理方法進行。

1.5 樣品采集與處理

在飼養至第21 d，每個重復選取1頭接近平均體重仔豬進行屠宰，取空腸和盲腸中段兩端雙線結扎，錫箔紙包被，再用保鮮膜裹好液氮保存，用于微生物測定。

1.6 盲腸內容物菌群組成與比例

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取盲腸內容物菌群DNA。對DNA 樣品進行檢測，檢測合格的樣品構建文庫：回收目的Amplicon 片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase 和T4 PNK 將打斷形成的黏性末端修復成平末端，再通過3'端加堿基“A”，使得DNA 片段能與3'端帶有“T”堿基的特殊接頭連接；最后，用合格的文庫進行cluster 制備和測序。

表1 飼糧組成與營養水平（風干基礎）

1.7 腸道內容物細菌計數

稱取空腸、盲腸內容物0.5 g 于無菌三角瓶。加入5 ml 經滅菌的生理鹽水，振蕩3～5 min 后，用移液槍準確吸取0.5 ml至盛有4.5 ml生理鹽水事先滅菌的青霉素瓶中，用旋渦振蕩器振蕩1～2 min，制成1/10稀釋液，依次進行102～106倍稀釋。分別將空腸及盲腸內容物稀釋液接種于相應的固體培養基上。每種指標檢測5 個稀釋梯度，每個梯度設3 個重復。大腸桿菌、沙門氏菌及總需氧菌于37 ℃有氧培養24 h 后進行菌落計數，產氣莢膜梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌于37 ℃厭氧培養48 h后進行計數。

1.8 統計分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計。以重復為單位，以P＜0.05為顯著性判斷標準。各處理數據以“平均數±標準差”表示，并分析比較不同方式處理的豆粕以及嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬微生態系統的影響差異。

2 結果與分析

2.1 微生物群落門水平豐度分析（見圖1）

由圖1可知，對照組以及各試驗組中腸道細菌共涉及12 個門，包含Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidete（擬桿菌門）、Euryarchaeot（廣古菌門）、Fibrobactere（纖維桿菌門）、Firmicute（厚壁菌門）、Unclassifie（未分類細菌）、Proteobacteri（變形細菌門）、Spirochaete（螺旋菌門）、Tenericute（軟壁菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）。其中，各試驗組中細菌種類主要為Bacteroidetes（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Unclassifie（未分類細菌）和Proteobacteria（變形細菌門）。膨化大豆組仔豬腸道內纖維桿菌門含量顯著高于對照組（P＜0.05），而對照組仔豬腸道內纖維桿菌門的含量幾乎為零。3%嗜酸乳桿菌培養物組以及5%嗜酸乳桿菌培養物組有一定量的纖維桿菌門。與對照組相比，發酵豆粕組及膨化大豆組仔豬腸道內擬桿菌門豐富度有所增加，但無顯著差異（P＞0.05）。嗜酸乳桿菌培養物組腸道中廣古菌門數量顯著高于對照組（P＜0.05），厚壁菌門數量雖有所增加，但無統計學差異（P＞0.05）；添加膨化大豆、嗜酸乳桿菌培養物均有降低試驗期仔豬腸道放線菌門數量下降；添加發酵豆粕、嗜酸乳桿菌培養物均能使仔豬腸道內變形菌門以及螺旋菌門的數量下降。飼料中添加3%嗜酸乳桿菌培養物能使仔豬腸道中軟壁菌門的數量減少。由此可知，飼糧中添加嗜酸乳桿菌培養物、發酵豆粕和膨化大豆均在一定程度上提高了斷奶仔豬腸道內擬桿菌門、廣古菌門、纖維桿菌門、厚壁菌門等有益菌的數量，降低了放線菌門、變形細菌門、螺旋菌門、軟壁菌門等有害菌的含量。

圖1 盲腸內容物菌群物種柱狀圖（門水平）

2.2 仔豬腸道微生物群落屬水平豐度分析（見圖2）

由圖2可知，進一步細化分類水平到屬（Genus），圖中共顯示豐度相對較高的24 個屬種，各試驗組的Lactobacillus（乳桿菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Megasphaera（巨球型菌屬）、Mitsuokella（光岡菌屬）、Blautia（布勞特氏菌）、Coprococcus（糞球菌屬）、Eubacterium（真桿菌屬）數量均高于對照組，對照組的Actinobacillus（放線桿菌屬）、Prevotella（普雷沃菌屬）、Campylobacter（弧形桿菌）、Clostridium-IV（梭狀芽孢桿菌四世）、Streptococcus（鏈球菌屬）數量高于各試驗組，且Lactobacillus（乳桿菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Megasphaera（巨球型菌屬）、Coprococcus（糞球菌屬）、Eubacterium（真桿菌屬）、Campylobacter（弧形桿菌）6種菌屬的含量存在顯著差異（P＜0.05）。3%嗜酸乳桿菌培養物、5%嗜酸乳桿菌培養物以及膨化大豆組的Collinsella（柯林斯菌屬）數量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖2 盲腸內容物菌群物種柱狀圖（屬水平）

2.3 Beta多樣性分析（見圖3）

由圖3可知，3%嗜酸乳桿菌培養物組（試驗Ⅲ組）和5%嗜酸乳桿菌培養物組試驗（試驗Ⅳ組）與對照組物種間的進化距離較遠，枝長較長，三者的物種組成存在一定的差異性。發酵豆粕組（試驗Ⅰ組）和膨化大豆組（試驗Ⅱ組）與對照組樣品也存在一定的距離。

圖3 仔豬盲腸內容物菌落聚類分析圖（weighted UniFrac）

2.4 盲腸內容物細菌計數

不同方式處理的豆粕及嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸及盲腸菌群的影響見表2。從表2 可知，不同方式處理的豆粕及嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸菌群（產氣莢膜桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌）無顯著影響（P＞0.05）。由盲腸細菌計數顯示，3%嗜酸乳桿菌培養物、5%嗜酸乳桿菌培養物及膨化大豆組仔豬盲腸的乳酸菌數顯著高于對照組（P＜0.05），但發酵豆粕組乳酸菌數與對照組差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比較，3%嗜酸乳桿菌培養物及5%嗜酸乳桿菌培養物使仔豬盲腸雙歧桿菌數顯著升高（P＜0.05）。各試驗組與對照組的沙門氏菌、產氣莢膜桿菌及大腸桿菌均數不存在顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

仔豬斷奶后會出現胃腸道的生理紊亂，表現為食欲差、飼料利用率低、抗病力下降、腹瀉等現象[9]。引起胃腸道功能紊亂不僅是胃腸道結構和生理的變化，而且還與腸道微生物密切相關[10]。腸道是動物機體內營養物質消化吸收的主要場所，同時也是機體最大的免疫器官。動物體內存在復雜的微生物群體，這些群體對宿主營養消化吸收、物質代謝及機體免疫等諸多方面起到重要作用[11]。

表2 不同方式處理的豆粕及嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸及盲腸菌群的影響lg（cfu/g）

研究發現，微生物群體多樣性增加通常與微生物區系的穩定性及抗病能力呈正相關[12]。在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門是動物腸道三種主要的細菌門類[13]。斷奶仔豬腸道內優勢菌群主要包括厚壁菌門中的乳桿菌屬、巨球型菌屬、糞球菌屬等，而腸桿菌科的比例提高可能導致壞死性腸炎等病癥[14]。李追[15]研究發現，肉仔雞飼糧中添加嗜酸乳桿菌，回腸微生物區系中厚壁菌門相對豐富度增加，變形菌門豐富度降低。本研究結果表明，通過門水平聚類分析，厚壁菌門和擬桿菌門為斷奶仔豬腸道中的優勢菌群。與對照組相比，添加嗜酸乳桿菌組腸道厚壁菌門數量有所增加，變形菌門數量降低，而廣古菌門數量顯著升高。屬水平上，乳桿菌屬數量顯著增加，弧形桿菌屬降低。添加發酵豆粕擬桿菌門數量有所升高，糞球菌屬數量顯著上升、弧形桿菌屬顯著降低。由此可知，飼糧添加發酵豆粕、膨化大豆及嗜酸乳桿菌在一定程度上提高斷奶仔豬腸道內有益菌群的數量，減少有害菌群的數量。而這些有益菌群不僅有利于維持盲腸微生物區系的穩定，一定程度上能改善腸道屏障功能[16]。

腸道菌群越豐富，分配越均勻，菌種之間相互依賴和制約性就越強[17]。暗示在應對應激狀態時菌群緩沖能力越強，能更好地維持腸道微生態系統平衡，減少應激帶來的危害[18]。

正常情況下，動物腸道內各菌群相互依存，共同維持腸道動態平衡，一旦腸道微生態平衡遭到破壞，有害菌就會大量繁殖，產生大量有害毒素，嚴重損害機體健康[19]。而仔豬斷奶階段，腸道內乳酸桿菌數量降低，大腸桿菌數量升高，腸道正常的微生態平衡被打破，易引發腹瀉等癥狀[20]。大量研究表明，益生菌作為飼料添加劑能夠改善斷奶仔豬腸道微生態系統。譙仕彥等[21]發現，乳酸菌在改善豬腸道屏障功能方面具有很好的作用，這種作用與乳酸菌對腸絨毛結構、腸道菌群結構、黏液的分泌、上皮細胞通透性和免疫功能的調節有關。郝小燕等[22]研究表明，益生菌不僅能黏附于腸黏膜，而且能明顯抑制致病菌黏附，從而提高腸道微生態的穩定性。研究也得到類似結果，通過盲腸細菌計數發現，飼糧添加嗜酸乳桿菌顯著提高盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數量，而膨化大豆組盲腸內乳酸桿菌數量顯著升高，這可能是通過競爭腸道內結合位點，抑制有害菌在腸道內的附著，同時也可能通過分泌乳酸、乙酸、丙酸等降低腸腔內pH 值，從而抑制有害菌的黏附與繁殖，有益菌發展為優勢菌群，促進微生態系統的平衡，加強腸道屏障功能。

4 小結

①飼糧添加發酵豆粕、膨化大豆嗜酸乳桿菌培養物均對斷奶仔豬盲腸微生物區系產生了影響，添加嗜酸乳桿菌培養物增加乳桿菌屬、擬桿菌屬相對豐富度，降低弧桿菌屬相對豐富度；添加膨化大豆及發酵豆粕增加擬桿菌屬相對豐富度，降低弧桿菌屬相對豐富度。

②飼糧添加發酵豆粕、膨化大豆及3%嗜酸乳桿菌培養物仔豬腸道菌群豐富度增加，抵抗應激能力相應增強，腸道微生態系統更加穩定,且相較之下3%嗜酸乳桿菌培養物組效果更佳。