杜仲皮水提物對虹鱒肌肉生肌調節因子家族（MRFs）基因表達的影響

■羅學評 張安青 袁國尚 姜海波，4* 文 明

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽550025；3.銅仁市農業農村局漁業技術推廣站，貴州銅仁554300；4.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州貴陽550025）

虹鱒(Oncorhynchus mykiss)是我國重要的冷水性經濟魚類。近年來隨其人工繁育和養殖技術的不斷成熟，養殖規模在不斷擴大，然而高密度養殖模式下的虹鱒肌肉品質也隨之下降。這成為限制虹鱒食用消費和加工利用的重要因素，制約了虹鱒養殖產業的健康、可持續發展。探尋改善虹鱒肌肉品質的方法已經成為學者的研究熱點。魚類肌纖維作為骨骼肌的基本構成單位，在某種程度上決定了肌肉的品質，其特征被普遍用于魚肌肉品質的評定[1-3]。肌纖維（Myofiber）是由胚胎發育過程中分化出的肌源性祖細胞，分化形成單核的成肌細胞（Myoblasts），然后單核的成肌細胞融合，形成多核的肌管（Myotube），肌管之間再相互融合而形成。并伴隨著一系列基因的表達變化。肌衛星細胞是一種特殊的肌源性干細胞，具有促進肌肉生長和自我修復的功能。而生肌調節因子家族（MRFs）在肌衛星細胞分化后期到肌管形成過程中發揮著關鍵的調控作用[4]。

MRFs 家族編碼4 種肌肉特異性轉錄因子，分別是生肌決定因子（myogenic determining factor，MyoD）、肌細胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）和生肌因子6（myogenic factor 6，Myf6），該家族控制著肌肉的發育，包括從前體肌細胞的定型、增殖及肌纖維的形成，直到個體出生后肌肉的成熟和功能的完善整個過程[5]。由此可見MRFs 的表達對肌肉品質的提升息息相關。杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)屬杜仲科，杜仲屬，具有很高的經濟價值和藥用價值[6]，是我國特有的經濟物種，在我國也有著豐富的資源。在傳統的中醫學中，杜仲具有除腰膝酸痛，補肝腎，延緩衰老，強筋骨，改善糖代謝等功效[7-8]。目前，杜仲除在醫學上得到廣泛應用外，近年來在動物養殖業中的研究和應用也呈增加趨勢，有關報道已見于草魚[9-12]、鯉魚[13]、異育銀鯽[14]、羅非魚[15]、豬[16-17]、雞[18]等，這些研究表明杜仲具改善肌肉品質，提高動物生長性能，改善機體免疫等功效。本研究團隊在前期的研究中發現飼料中添加1%、4%的杜仲皮水提物能顯著降低虹鱒肌纖維直徑，肌纖維的密度隨著杜仲水提物濃度的增加而增大，0.5%、1%、2%、4%組的肌纖維密度均顯著高于0%組[19]。本研究通過在虹鱒的基礎飼料中添加不同濃度的杜仲皮水提物，分析其對虹鱒肌肉MRFs 基因表達的影響，以期從分子生物學方面初步探究杜仲皮水提物對肌纖維調控的機理，為杜仲作為水產動物肉質改良劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

基礎飼料（山東升索漁用飼料研究中心生產的商業虹鱒飼料）含粗蛋白質為42.0%、粗脂肪為18.0%、粗灰分為8%、粗纖維為6%，經粉碎過40 目篩后稱重備用。試驗共設5 個處理組，在基礎飼料中分別添加質量分數為0%（對照組）、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的杜仲皮水提物。試驗用杜仲樹皮采購于貴州省貴陽市援生醫院（產地：四川省古藺縣），經研磨機制成粉末后過60 目篩網，分別稱取杜仲皮粉末0、5.0、10.0、20.0 g 以及40.0 g 分別放入1 000 ml 的蒸餾水中煮沸4 h，經300 目尼龍濾網過濾，并將濾液濃縮至100 ml，得到水提物。將100 ml不同濃度杜仲皮水提物和300 ml 蒸餾水與1 kg 已粉碎的基礎飼料混勻，經制粒機制作成直徑1 mm的顆粒飼料，風干，保存在-20 ℃的密封塑料袋中備用。

1.2 試驗用魚的飼養管理

隨機選取體質健康，大小均勻（145.56±4.12）g的虹鱒進行試驗。試驗分為5個處理組，每組3個重復，將15口網箱（規格1.0 m×1.0 m×1.2 m，有效水體積為600 L，每口網箱投放30尾虹鱒）分別置于3口室外流水水泥池內（流速為0.04 m/s，水溫為12.8～14.1 ℃，溶氧濃度≥7.5 mg/l，氨氮＜0.05 mg/l，pH值7.6～8.4）。在自然光照條件下，養殖10周，每日投喂4次，緩慢投喂（每隔5 min 投喂一次），連續投喂至飽食為準。投喂時間分別為09：00、12：00、15：00和18：00。

1.3 樣品采集

將養殖試驗結束后的虹鱒饑餓24 h，每口網箱隨機選取2 尾，用MS-222 麻醉后迅速在冰盤上進行解剖，取側背白肌，放入液氮罐中，-80 ℃下保存備用。

1.4 樣品總RAN的提取

總RNA 的提取參照RNA simple Total RNA Kit說明書進行。然后對所得總RNA 樣品進行質量檢測，用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠檢測虹鱒肌肉組織總RNA 質量。根據28S 和18S 的亮度及比值判斷RNA的完整性。微量核酸測定儀測量總RNA濃度以及波長為260 nm和280 nm的吸光度。

1.5 cDNA模板的合成

使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific?）對總RAN 進行反轉錄反應。提前將無菌無RNase污染的PCR管置于冰上，按照順序加入表1 的反應物，將模板和引物的混合液輕輕混勻，短暫離心15 s，65 ℃孵育5 min，冰上冷卻，離心15 s，再置于冰上冷卻。再按順序加入表2組分。輕輕混勻，離心15 s，放入42 ℃的水浴鍋中孵育60 min。70 ℃加熱5 min終止反應，反應產物可直接用于PCR反應或者在-80 ℃保存。

1.6 Real-Time PCR檢測

從NCBI中下載虹鱒MRFs基因及內參基因β-actin 全序列，利用Primer 5.0 軟件設計特異性引物（見表3，由上海生工生物工程技術有限公司合成）。以虹鱒肌肉中的cDNA 為模板，用設計好的引物進行Real-Time PCR 反應，檢測虹鱒肌肉MRFs 轉錄水平。反應體系見表4，反應程序為：預變性95 ℃150 s；變性94 ℃15 s；退火58 ℃30 s；39循環。

表1 第一鏈cDNA合成體系(1)

表2 第一鏈cDNA合成體系(2)

表3 引物序列及擴增片段大小

表4 反應體系

2 數據統計與分析

用熒光定量PCR 方法檢測不同濃度的杜仲水提物對MRFs 基因家族表達的影響，為了進一步清晰地表示出杜仲水提物添加組與正常對照組基因表達之間的關系，將對照組的基因表達量調整為1，用2-△△CT法計算MRFs 家族基因mRNA 的相對表達量，采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan's法多重檢驗分析組間差異顯著性，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

3 結果

3.1 虹鱒肌肉總RNA質量檢測

對虹鱒肌肉總RNA 提取后，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1，圖1 中28 S 和18 S 條帶清晰可見，且灰度值約為2:1，而5 S 帶幾乎沒有，說明總RNA 無明顯降解。利用微量核酸測定儀測定總RNA的純度及濃度，結果顯示濃度在200 mg/μl 以上，A260 nm/A280 nm 均 在1.90～2.10 之 間，未 檢 測 到DNA及蛋白污染，說明提取的總RNA符合試驗要求，可用于后續RT-PCR和qPCR反應。

圖1 虹鱒肌肉總RNA的質量檢測

3.2 MRFs和β-actin的普通PCR擴增摸索反應條件

用引物對虹鱒肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG和βactin 基因進行擴增，PCR 產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明擴增片段與預期大小一致，條帶單一且無非特異性擴增雜帶及引物二聚體，說明可以用于熒光定量PCR的檢測（如圖2所示）。

圖2 虹鱒肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG和β-actin基因擴增圖

3.3 實時熒光定量PCR產物特異性分析(圖3～圖10)

經肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG基因和β-actin基因擴增曲線分析，擴增曲線均呈現“S”形，表明這五個基因動力學曲線平行性較好，曲線拐點清晰，基線平行無上揚趨勢，最后進入平臺期，表明稀釋濃度合適。經溶解曲線分析，Myf6、Myf5、MyoD、MyoG基因和β-actin基因的溶解曲線只呈現一個標準的單峰，說明了擴增產物的特異性良好，沒有出現其他的非特異性產物，其溶解溫度分別為86.0、88.0、87.5、84.0 ℃和87.0 ℃。

3.4 杜仲水提物對虹鱒肌肉MRFs 相對表達量的影響

圖3 β-actin與MyoD基因擴增曲線

圖4 β-actin與MyoG基因擴增曲線

杜仲水提物對虹鱒肌肉Myf6、Myf5、MyoD 和MyoG 基因相對表達量影響的結果如圖11～圖14。各處理組之間肌肉Myf6、MyoD和Myf5基因表達量差異不顯著（P＞0.05）。2.0%組肌肉MyoG基因表達量顯著高于其他各處理組，4.0%組肌肉MyoG 基因表達量顯著高于對照組、0.5%組和1%組（P＜0.05）。

圖5 β-actin與Myf6基因擴增曲線

圖6 β-actin與Myf5基因擴增曲線

圖7 β-actin與Myf6基因溶解曲線

圖8 β-actin與Myf5基因溶解曲線

圖9 β-actin與MyoD基因溶解曲線

圖10 β-actin與MyoG基因溶解曲線

4 討論

生肌調節因子（muscle regulatory factors，MRFs）基因家族對肌肉的調控作用主要體現在對肌細胞命運的決定，成肌細胞增殖和分化、肌纖維的形成等方面。MRFs基因家族是1987年由Davis等首次發現[20]，而后Braun等[21]和Tapscott 等[22]根據人與小鼠MyoD的同源性，于1989年從人類胎盤的骨骼肌cDNA文庫中分離得出（myogenic determining factor，MyoD）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）、肌細胞生成素（myogenin，MyoG）和生肌因子6（myogenic factor 6，Myf6），它們是控制骨骼肌生成的關鍵調節因子，共同控制肌肉的生成[23]。

圖11 杜仲水提物對虹鱒肌肉Myf5 mRNA表達的影響

圖12 杜仲水提物對虹鱒肌肉Myf6 mRNA表達的影響

圖13 杜仲水提物對虹鱒肌肉MyoD mRNA表達的影響

圖14 杜仲水提物對虹鱒肌肉MyoG mRNA表達的影響

本研究發現2.0%和4.0%組的MyoG mRNA 表達顯著高于對照組。MyoG 作為骨骼肌分化所必需的因子，它是MRFs 基因家族中唯一能夠在所有骨骼肌細胞中均表達的基因，且在肌細胞的形成過程中具有中心調控作用，它與肌纖維的直徑、大小、數量以及密度密切相關[24]。MyoG 基因通過控制成肌細胞的融合和肌纖維的形成來對肌肉的分化作用產生影響，其對脊椎動物肌細胞分化和骨骼肌系統的發育成熟具有重要意義[25]。Hasty 等[26]的研究表明，MyoG基因敲除的小鼠出生后會發生嚴重的骨骼肌發育缺陷，說明該基因對骨骼肌的形成有重要的作用。MyoG 基因可以調節自身表達，也可以與其他成員相互作用，彼此調節。當胚胎干細胞中缺失MyoG 時完全分化的肌纖維由過量表達的Myf6 產生[27]。但是，MyoG 調控著中胚層細胞分化為成肌細胞，再由成肌細胞融合為肌纖維[28]，這是一個不可替代過程。本研究還發現各組之間Myf5、MyoD 和Myf6 mRNA 表達量無顯著差異，但2.0%和4.0%組Myf6 mRNA 的表達量變高于對照組，這一變化趨勢與MyoG 基因變化相似。根據結構及功能的不同，將MRFs 基因家族分為兩類，初級MRFs 和次級MRFs。初級MRFs 主要指Myf5 和MyoD，兩者同源性較高，且在成肌分化中兩基因在功能上存在互補。當阻隔MyoD 表達時Myf5會發生代償性高表達，骨骼肌仍能發育；當阻隔Myf5 的表達，則不能生成早期的肌節，但隨后MyoD會被激活而表達，肌肉仍可形成；若Myf5 和MyoD 均缺失，則無前體成肌細胞生成，個體將無法產生肌肉[29]。次級MRFs 為MyoG 和Myf6（MRF4）。它們在Myf5和MyoD 的下游表達，在肌細胞的終末分化以及肌纖維成熟及維持方面起作用[30-31]。若缺乏MyoG，則無肌纖維形成；若缺乏Myf6，個體雖能夠形成骨骼肌，但會因為肋骨發育缺陷，在出生時就死亡[32]。有研究表明MyoG 基因主要在胚胎骨骼肌發育階段調控肌管的形成方面有重要作用，而Myf6 則是促進肌纖維的形成以及與肌肉的分化狀態有關[33]，兩者之間具有是相輔相成，相互促進的作用。本研究中2.0%和4.0%組的Myf6 和MyoG mRNA 的表達均高于對照組，可能是由于Myf6 和MyoG 基因相互促進作用而引起的。

5 結論

飼料中添加杜仲水提物對虹鱒肌肉MyoD、Myf6和Myf6 mRNA 表達無顯著影響，但添加2.0%和4.0%的杜仲水提物可以顯著提高虹鱒肌肉MyoG基因表達量。杜仲皮水提物可通過調控虹鱒肌肉MyoG基因的表達以實現肉質改善。