木麻黃內生真菌對其幼苗葉綠素相對含量及熒光參數的影響

林燕青，謝安強，林 晗，洪 滔，陳 燦，吳承禎

（1.福建農林大學林學院，福州 350002；2.福建省高校森林生態系統過程與經營重點實驗室，福州 350002；3.武夷學院生態與資源工程學院，福建 南平 354300）

木麻黃（Casuarina equisetifolia L.）為常綠喬木，原產于澳大利亞，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區[1]，也是福建等地沿海海岸防護林主要樹種。目前，木麻黃存在著林分二代更新困難、連栽導致生產力下降、防護功能減退的問題，這些問題都嚴重制約著木麻黃沿海防護林長期生產力的維護[2-4]。葉片是植物進行光合作用的重要器官，而葉綠素是植物光合色素中的重要色素分子，影響著植物對外界資源的利用及生物量的積累，是測定植物生長和營養狀況的重要指標[5-8]。

對于植物葉綠素含量的測定方法中，傳統浸取法步驟煩瑣，耗時長，且葉綠素的損失較大，而SPAD-502 葉綠素相對含量測定法和葉綠素熒光分析技術是一種以光合作用為理論基礎，利用植株體內葉綠素為天然探針，研究、探測植物光合生理狀況及對外界因子的各種響應的新型植物活體測定和診斷技術，測定過程中均不會對葉片造成損傷，與其他苗木生理狀況評價方法對比，具有對細胞無損傷、快速和靈敏等優點，是用于探測外界特殊環境條件下植物生理狀況和光合作用能力的很好工具，且植株對特殊環境條件的適應程度與SPAD 值（即植物體內相對葉綠素含量）、Fv/Fm （即PS II 的最大或潛在的光化學效率，反映的是PS II 原初光能轉化效率）、Yield（即PS II 實際光化學量子效率，反映了植物目前的實際光合效率）和qN（即非光化學淬滅系數）等參數有顯著相關性，因此可作為觀察接菌植物生長狀況的指標[9-16]。植物內生真菌作為一種新型的天然活性物質資源寶庫，近年來在促進植物生長、提高樹木的抗逆能力和新陳代謝、促進植物天然物和代謝物分泌等方面均取得許多成果，關于利用葉綠素熒光分析技術評價植物外生菌根菌、AM（叢枝菌根Arbuscular mycorrhizae）真菌和根際促生細菌等對植物光合作用影響的報道已多見[17-24]，但將其應用于木麻黃內生真菌方面的研究尚未見報道[25-32]。為了探究木麻黃內生真菌是否對其生長過程中葉綠素相對含量以及熒光參數存在影響，不同的內生真菌是否存在差異，侵入方式之間對內生真菌影響效應，筆者進行較系統的研究，旨在科學回答內生真菌對木麻黃的葉綠素以及熒光參數存在影響的效應。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及菌液的制備

28 株供試內生真菌包含青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus spp.）、葉點霉屬（Phyllosticta spp.）、擬莖點霉屬（Phomopsis spp.）和鐮刀菌屬（Fusarium spp.）5 種屬別，其中青霉屬菌株有2株，分別為菌株3 和菌株6；曲霉屬菌株13 株，分別為菌株 5、7、13、14、17、20、23、25、30、37、53、57、63；葉點霉屬菌株 7 株，分別為菌株 15、16、19、22、24、27、43；擬莖點霉屬 1 株，為菌株 18；鐮刀菌屬 5 株，分別為菌株 45、46、50、52、54，均由本實驗室采集于木麻黃植株全株[33]，目前部分菌種已保存于中國科學院微生物菌種保存中心，本研究中的部分菌株應用已獲得國家發明專利（ZL201310068759.9、ZL201310068792.1、ZL201310068793.6）。

將純化后的菌株用接種環挑取少量菌體（不含瓊脂塊），接入盛有60 mL 液體培養基 （含蛋白胨5.0 g，K2HPO41.0 g，酵母粉 2.0 g，MgSO40.5 g，葡萄糖 20.0 g；pH 6.8）的小錐形瓶中，然后將錐形瓶置于搖床內，于24 ℃轉速120 r/min 下培養3 d 得到菌液[34]。將60 mL 菌液與90 mL 無菌水混合稀釋，利用血球計數板檢測稀釋后菌液的濃度，濃度為8.75×105cfu/mL，接菌時配備 150 mL 該濃度的菌液，本試驗所有接菌方式的菌液都采用這種濃度和劑量，以保證接菌時除了接菌方式不同，其他條件均一致。

1.2 無性系來源及處理

試驗枝條采自多年生截桿母樹上萌芽的小枝，共約3 400 余根，由福建省泉州市惠安縣赤湖國有防護林場木麻黃惠安一號采穗圃提供。小枝長度約7～10 cm，用 60 mg/L （60×10-6）的萘乙酸浸泡至其基部2 cm 處，浸泡24 h 后立即用去離子水沖洗干凈，放入滅菌后的小玻璃瓶中水培生根，去離子水沒入小枝基部3 cm，白天力求陽光直射小枝，夜間移入室內保溫，每天更換去離子水一次。木麻黃小枝水培22 d 后，得到選取出植物長度、分枝和根長基本一致的植株共2 584 株，其中留近半數的幼苗備用，其余幼苗移植盆栽中培養。

苗木移植與管理：用于移植的盆中各裝有等量混合比例為3∶1 的黃心壤土和沙的混合土壤，并提前一天滴入10～15 滴/盆的甲醛（福爾馬林）消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24 h；苗木移植后在其生長的任何時期，均不施用任何肥料；盆栽苗均放置于試驗地上由厚質透光塑料膜搭建的溫室大棚里，除日常苗木管理以外，任其自由生長。

1.3 內生真菌的侵染

水培苗起苗時浸泡于菌液的方式簡稱S 方式（下同），先將水培獲得的近半數幼苗用清水清洗干凈，再用蒸餾水沖洗3 遍，接著將幼苗根系浸泡在貼了不同標簽的菌液當中，每瓶菌液150 mL 平均浸泡15～20 株小苗，剛浸泡時，輕輕地搖動小苗，使其與菌液充分接觸，隨后室內放置10 h；浸泡完畢，用蒸餾水清洗3 次，最后將幼苗移植盆栽。

水培苗移植盆栽后澆灌菌液的方式簡稱P 方式（下同），將水培獲得的近半數幼苗先移植盆栽，經過一周的恢復生長后再進行接種試驗。接種方法為連續3 d 在木麻黃小苗根際周圍均勻澆灌菌液150 mL，一個處理接菌苗木15～20 株。

本試驗設對照苗木54 株，不接種任何菌株，其他處理相同，僅澆灌水溶液作為空白對照。本試驗中的兩種不同侵染方式同時進行，且內生真菌的定殖時間均為4 個月。

1.4 葉綠素相對含量測定

應用便攜式葉綠素含量測定儀（SPAD-502，Minolta，Tokyo，Japan），測定葉中部的 SPAD 計數值代表葉綠素的相對含量。每個處理測定10 株，每株選取整個植株中間部位、同朝東南方向的枝條，采取5 根枝條并排壓平的方式測量取平均值。

1.5 葉綠素熒光參數測定

應用 Photon Systems Instruments（PSI）公司生產的 Handy FluorCam 熒光成像儀在夜間19：00—22：00測定木麻黃苗木的葉綠素熒光參數，測定前先將苗木放入暗箱內，充分暗反應20 min，隨后將苗木放于攝像頭之下，調節焦距至能看清葉片圖像為止。

測量的原始參數有：Fo（最小、基礎或不變熒光強度等） 是光系統Ⅱ（PSⅡ）反應中心所有電子均處于完全開放時的熒光產量，它與葉片的葉綠素濃度有關；Fm（最大熒光） 是葉片經暗適應 20 min 后，光系統Ⅱ（PSⅡ）反應中心處于完全關閉時的熒光產量，可反映PSⅡ的電子傳遞情況；Fo'：（光下最小熒光）是光適應狀態下全部PSⅡ中心都開放時的熒光強度；Fm'（光下最大熒光） 是光適應狀態下全部PSⅡ中心都關閉時的熒光強度。

1.6 數據處理

所有數據處理以及圖表制作均采用Excel 和SPSS 軟件，用單因素方差分析和Duncan 多重比較法（P＜0.05）對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同接菌方式不同菌株處理對水培苗葉綠素相對含量的影響

在不同接種方式下，將28 株菌株分別接種后，分析不同接菌方式不同菌株處理后葉綠素相對含量，圖1只列出不同接種方式表現好的前15 種菌株。由圖1可以看出不同接菌方式不同菌株處理下，苗木葉綠素相對含量（SPAD 值）存在差異，不同直方圖代表不同接菌方式下苗木葉綠素相對含量的變化，實驗結果表明，S 接菌方式下苗木的葉綠素相對含量均大于P 接菌方式下苗木的葉綠素相對含量；而P 接菌方式下，接菌苗木的葉綠素相對含量均低于對照苗木的葉綠素相對含量，說明P 接菌方式下菌株對苗木的光合作用未起到促進作用。

對S（水培浸泡）接菌方式下葉綠素相對含量的方差分析表明，各菌株處理之間的苗木葉綠素相對含量存在顯著差異，經過Duncan 多重比較分析，各處理的葉綠素相對含量較對照有顯著提高，如表1所示。

與對照CK 木麻黃苗木相比，S 接菌方式下，葉點霉屬的22 號和43 號菌株處理、鐮刀菌屬的46號菌株處理達到極顯著差異水平，分別增加了27.5%、26.88%和 31.34%。另外，除了菌株 24 號、15號和14 號處理對木麻黃苗木葉綠素相對含量無提高以外，其他菌株處理對苗木葉綠素相對含量也有一定提高作用，并且鐮刀菌屬的46 號菌株處理對苗木葉綠素相對含量的提高作用與其他屬種的菌株 37 號、23 號、18 號、16 號和 13 號相比，差異達到極顯著。

2.2 不同接菌方式不同菌株處理對水培苗Fm、Fv和Fv/Fm的影響

熒光分析當中，Fm 和Fv 均反映著光系統Ⅱ的光化學活性。最大熒光（即Fm） 是光系統Ⅱ（即PSⅡ） 反應中心處于完全關閉狀態下的熒光產量，它既可以反映光系統Ⅱ的電子傳遞情況，也能反映光是否受到抑制的情況（當Fm 降低時）；可變熒光（即Fv）為Fm 與Fo 之差，反映著光系統Ⅱ的電子受體——初級醌受體（即QA）的還原情況，研究發現，Fv 值的變化程度反映著植物對周圍環境脅迫的忍耐能力[35]。

圖1 不同接菌方式不同菌株處理下苗木葉綠素相對含量比較Figure 1 Comparison of the seedlings SPAD under different inoculated methods and treatments

表1 水培接菌方式不同菌株處理下葉綠素相對含量的多重比較分析Table 1 The multiple comparison analysis of SPAD among different inoculated treatments under the S method

在顯著性水平為0.05 的前提下，單因素方差分析結果表明，S 接菌方式和P 接菌方式下，不同菌株接菌處理間的Fm、Fv 值差異顯著情況如圖2所示。

如圖2所示，S 接菌方式下，除了菌株23 號以外，其他各菌株處理的Fm 值均較對照CK 有顯著的提高，其中葉點霉屬的菌株16 號與其他接菌菌株相比，差異達到顯著水平，為對照苗木的2.13 倍；P 接菌方式下，除了菌株 5 號、24 號、27 號和 50 號以外，其他各接菌植株的Fm 值也均較對照CK 有顯著的提高，但是增長幅度不如S 接菌方式，其中曲霉屬的菌株7 號和25 號處理下的苗木，其Fm 值與其他接菌菌株相比，差異達到顯著水平，分別較對照提高了39.57%和30.69%。

圖2 不同接菌方式不同菌株處理下苗木Fm、Fv 的比較Figure 2 Comparison of the seedlings Fm and Fv under different inoculated methods and treatments

S 接菌方式下，除了菌株23 號以外，其余14 株接菌植株的Fv 均顯著高于對照植株，其中葉點霉屬的菌株16 號較其他接菌菌株的增幅最大，為對照苗木的2.21 倍；P 接菌方式下，接菌植株的Fv 值與對照CK 相比，有小幅度的增長，曲霉屬的菌株7號和25 號作用下，苗木的Fv 值顯著高于對照植株，分別提高了42.83%和34.81%。

熒光參數中，PSⅡ的實際光化學效率（即Fv/Fm）是研究植物光合生理狀態的重要參數，反映著植物的潛在光合能力，同時也是研究植物脅迫的重要參數，在非脅迫的環境條件下，植物的物種與生長條件對其影響不大，該參數值保持在0.75 與0.85 之間，一旦受到外界脅迫作用，Fv/Fm 呈現明顯的下降趨勢，其值的減小意味著光系統Ⅱ反應中心的光化學損害與光能熱耗散的增加[36-37]。對Fv/Fm 數據進行單因素方差分析，S 接菌方式和P 接菌方式下，不同菌株接菌處理間的Fv/Fm 值差異顯著情況如圖3所示。

圖3 不同接菌方式不同菌株處理下苗木Fv/Fm 的比較Figure 3 Comparison of the seedlings Fv/Fm under different inoculated methods and treatments

如圖3所示，S 接菌方式下，除了菌株17 號以外，其他14 株接菌植株的Fv/Fm 均高于對照CK，其中有9 株極顯著高于對照植株，曲霉屬的菌株13號處理下的苗木與對照CK 相比增幅最大，達到8.05%；P 接菌方式各菌株處理的苗木，其Fv/Fm 也較對照有一定的提高，但與對照之間差異不顯著，Fv/Fm 值最大的為青霉屬的菌株6 號處理，與對照苗木CK 相比，僅增加了4.10%；兩種接菌方式中的共有曲霉屬菌株23 號和葉點霉屬菌株24 號，其Fv/Fm 的值，均為S 接菌方式大于P 接菌方式。結果說明了接菌處理有利于提高苗木的潛在光合能力，增強其對外界條件的適應能力，鑒于Fv/Fm 還是植物抗寒性的重要指標，且已在花旗松、茶樹和甘蔗中得到應用[38-40]，因此，內生真菌的回接是否還能提高木麻黃水培苗木的耐寒性，還有待于進一步的試驗研究。

2.3 不同接菌方式不同菌株處理對水培苗ΦPSII、Rfd和NPQ的影響

ΦPSII 能準確反映植物當前PSII 反應中心的實際光合效率狀況，其值越大，光合結構電子傳遞能力越強，參與光化學反應的光能份額越大，越有利于提高植物的光合能力[41]，由表2和表3的參數特征值可以看出，S 接菌方式各接菌處理下，ΦPSII的值均大于對照CK，且在顯著性水平為0.05 的前提下，曲霉屬的菌株14 號、鐮刀菌屬的菌株45 號、葉點霉屬的菌株43 號、鐮刀菌屬的菌株46 號、曲霉屬的菌株17 號和13 號處理下苗木的ΦPSII 分別較對照顯著增加了 61.09%、57.98%、53.31%、44.75%、40.08%和37.74%；P 接菌方式各接菌處理的ΦPSII 值也均高于對照CK，其中曲霉屬的菌株25號處理和對照相比增幅最大，顯著增加了55.25%。

表2 S 接菌方式不同菌株處理下木麻黃水培苗葉綠素熒光參數的特征值Table 2 Eigenvalues of chlorophyll fluorescence parameter of the water-cultured Casuarina seedling among different inoculated treatments under the S method

表3 P 接菌方式不同菌株處理下木麻黃水培苗葉綠素熒光參數的特征值Table 3 Eigenvalues of chlorophyll fluorescence parameter of the water-cultured Casuarina seedling among different inoculated treatments under the P method

Rfd 為葉片活力指標，反映葉片光合作用活力，即葉片潛在的光合作用量子轉化效率，與植物光合作用呈線性關系，可直觀反映植物的光合作用能力。S 接菌方式下，除了菌株 23 號、37 號、17 號和24 號處理以外，其他11 個菌株處理下苗木的Rfd值均高于對照苗木，且曲霉屬的菌株20 號、擬莖點霉屬的18 號和葉點霉屬的19 號處理分別較對照CK 顯著增加了 46.95%、40.85%和 19.92%；而 P 接菌方式下，各菌株處理下苗木的Rfd 值全部都小于對照苗木，其中的共有菌株24 號，無論S 還是P 接菌方式下，Rfd 值均為最小，說明該菌株的回接對木麻黃苗木的光合作用影響不大。

非光化學淬滅系數（NPQ）則為 PSⅡ天線色素吸收的光能以熱的形式耗散掉的份額，其值越大，則表示植物用于熱耗散的光能越多，植物光合作用的實際光能相應減少，從而降低植物的光合效率[42]，但是關于植物NPQ 值與光合作用的關系，目前有兩種不同的觀點：何炎紅等[43-45]研究認為，NPQ 值的減小反映出苗木葉片的非化學能量耗散減少，這有利于促進同等外界條件下的苗木高效地利用所捕獲的光能，以便更有效地利用于光合作用，因此，NPQ的值越小，苗木的光合性能越好；然而鄭淑霞等[46]對闊葉樹種葉綠素熒光特性的研究發現，植物NPQ 的值同qP 的值呈現極顯著正相關，NPQ 的提高并未降低植株的光合效率。本試驗結果顯示，S 接菌方式下，接菌苗木的NPQ 值較對照相比有上升的趨勢也有下降的趨勢，其中Rfd 值表現好的擬莖點霉屬菌株18 號、葉點霉屬菌株19 號和曲霉屬菌株20 號處理在NPQ 值的測定當中也均顯著大于對照苗木，分別增加了337.94%、137.06%和234.71%，因此本研究同鄭淑霞等人的研究結果相似，認為不能一概判定NPQ 的值越大光合效率越低，同時王麗敏[47]對杉木葉綠素熒光參數的研究中也得到這一結論；P 接菌方式下，僅鐮刀菌屬菌株54 號的NPQ 值大于對照苗木，較對照增加了17.65%，不如S 接菌方式下菌株18 號的增加量，P 方式其他14 個菌株均小于對照苗木的NPQ 值。

3 討論與結論

光能被植物光合色素吸收后的去向有3 種：參與光化學反應；以熱散失形式消失；熒光形式消耗。近年來葉綠素計SPAD-502 在農作物和林業技術上的應用逐漸廣泛，其較傳統分光光度計測定葉綠素的絕對含量來得方便快捷，易于攜帶特別適合林業研究的野外調查，能夠快速、無損地測定活體葉片的葉綠素相對含量[48-51]，前人研究表明SPAD 值與葉綠素含量具有顯著的相關性，結果差異不大，在一定條件下具有較強的一致性[52-55]；而葉綠素熒光分析技術也已被廣泛應用于植物光合性能預測、植物抗逆生理以及農作物增產潛力測試等方面，大量的研究報道表明植物體內發出的葉綠素熒光不僅僅是一種現象，更包含了豐富的光合作用訊息，可被定量分析和評價其光合機構的功能及外界脅迫對其的影響[18，36，56-59]，因此植物葉綠素的相對含量和葉綠素熒光參數均能反應植物光合產物積累的情況，也同植物的光合作用能力有很大聯系，其中，Fv/Fm這一葉綠素熒光參數比值，是目前被廣泛用于衡量植物葉片光合性能的重要指標[22，48]。

試驗結果表明，接種內生真菌對木麻黃水培幼苗的光合作用有顯著的促進作用，且隨著接菌方式及菌株處理的不同而異，試驗中不同接菌方式不同菌株處理下的Fv/Fm 值均在0.8～0.9 之間。國外學者[60-61]研究表明，受脅迫葉片的該值一般在0.3～0.7之間，而在非脅迫條件下，健康葉片則在0.8～0.9 之間，這說明了本試驗中的苗木在接菌后生長良好，且S 接菌方式下的菌株處理，對苗木的Fv/Fm 值有顯著促進作用；S 和P 接菌方式中，共有的菌株為曲霉屬的23 號和葉點霉屬的24 號，從葉點霉屬24號處理苗木的Fm、Fv 值來看，水培接菌方式效果較盆栽接菌方式的好，但從曲霉屬23 號處理苗木的Fm、Fv 值來看，盆栽接菌方式效果較水培接菌方式的好，說明內生真菌對苗木光合生長的促進作用，會隨著其對苗木的侵染定殖時間增長，而表現出更加明顯的互利共生的效果，但P 接菌方式下的苗木仍然有待于進一步觀察和研究。

葉片光合作用活力的測定中，S 接菌方式下苗木的Rfd 值顯著高于對照苗木，而P 接菌方式下苗木的Rfd 值均小于對照苗木，與葉綠素相對含量的測定結果呈現了相似的規律，也同前期對該處理下新梢生長量的測定結果有一定的關聯；大多數研究認為促生細菌對植物的光合作用影響是一種間接影響，即通過改善土壤性質，提高植物根系對水分、礦質營養等物質的吸收能力，從而最終提高植物的光合性能。本研究表明接種內生真菌有利于提高木麻黃苗木光系統Ⅱ的實際電子傳遞量子效率，增大用于光化學份額的光能，即加快苗木的實際光合效率進程，同時還能提高木麻黃苗木葉片光合作用活力，加速葉片潛在光合作用量子的轉化，是否與接菌菌株能夠改善土壤性質或促進木麻黃幼苗根系生長有關尚不明確，不同接菌方式和不同菌株處理的結果有一定差異，并且最佳接菌方式和功能菌株尚未確定，有待于對幼苗進行繼續培養及測定研究。