基于線粒體基因nd5對長江上游黑尾近紅鲌遺傳多樣性分析

嚴太明，王雄延，羅 杰，李 松，張 騫，何 亮，張松培，何佳洋，何 智

（四川農業大學動物科技學院，四川 成都 611130）

黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda），隸屬于鯉科（Cyprinidae）、鲌亞科（Cultrinae）、近紅鲌屬（Ancherythroculter），是長江上游特有魚類，主要分布于四川和重慶境內的長江干流及其支流[1-3]。近年來，由于過度捕撈、水利水電工程修建、水體污染和其他人為因素的影響，黑尾近紅鲌種群數量急劇下降[4-6]。基于滅絕風險指數（ERI）和優先保護程度分析發現，急需對長江上游黑尾近紅鲌采取保護措施[7-8]。

遺傳多樣性研究結果能為制定科學有效的物種保護策略提供重要信息[9-10]。基于線粒體基因cytb，Liu H.Z.等[5，11]發現龍溪河、習水河和木洞河黑尾近紅鲌群體遺傳多樣性水平較高，而其遺傳多樣性水平有明顯的下降。人工大壩的修建改變了支流群體與干流群體間的基因交流方式，棲息地環境的破壞、過度捕撈等導致的種群數量快速下降，可能是物種遺傳多樣性在短期內顯著降低的主要原因[12]。因此，為評價既有保護措施的有效性和實施有針對性的保護策略，有必要對黑尾近紅鲌的遺傳資源現狀進行再評估。

本研究采集了長江干流合江段、支流龍溪河和瀨溪河野生黑尾近紅鲌樣本，對其線粒體NADH脫氫氧化酶亞基5（NADH dehydrogenase subunit 5，nd5）序列的擴增和分析，評估了其遺傳多樣性和遺傳結構現狀，旨在明確支流和干流種群以及支流種群間是否存在遺傳分化，以期為黑尾近紅鲌野生資源的保護和合理開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

89 個野生黑尾近紅鲌樣本于2016年7月—2017年11月分別采自長江干流合江段（HJ），長江一級支流龍溪河（LOR）以及沱江（長江的一級支流）一級支流瀨溪河（LAR）（圖1），采集地信息見表1。對其進行形態學鑒定后，取胸鰭保存于無水乙醇中，備用。

表1 黑尾近紅樣本基本信息Table 1 Sample information of A.nigrocauda populations

1.2 DNA提取

取胸鰭組織約100 mg，加入600 μL 組織裂解液（0.01 M Tris-HCl，pH 8.0；0.1 M EDTA；5 g/L SDS）勻漿后加入 10 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL），56 ℃消化5 h 后，酚-氯仿法抽提基因組 DNA[13]。用 30 μL 1×TE Buffer 溶解乙醇沉淀后的DNA 樣品，-20 ℃保存，備用。

1.3 引物設計和PCR擴增

根據NCBI 報道的黑尾近紅鲌線粒體基因組全序列（GenBank 登錄號：KC513573），利用 Primer Premier 5.0 設計 nd5 序列引物（F：GTTCATCCATTGGTCTTAGG，R：CTCGTTGAATGTCGCTTGTA），并送成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

PCR 反應體系為 40.0 μL，其中包括 2×Taq PCR Master Mix（成都擎科梓熙生物技術有限公司）20.0 μL，上、下游引物各 2.0 μL（10 mM），模板 DNA 4.0 μL，加雙蒸水至總體積 40.0 μL。PCR 反應條件為94 ℃預變性3 min；然后35 個循環，每一個循環包括 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至成都擎科梓熙生物技術有限公司完成目的片段回收及測序。

圖1 黑尾近紅鲌樣點分布圖Figure 1 The sampling locations of A.nigrocauda

1.4 數據分析

運用DNAstar 軟件對所得序列進行校對和拼接，并在此基礎上使用MEGA 7.0 進行堿基組成統計、群體間遺傳距離的計算；使用DnaSP 5.0 軟件計算各群體的單倍型數（n）、變異位點數、單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（π）和基因流（Nm）等；Arlequin 3.5 軟件計算群體間遺傳分化系數（Fst），并進行群體AMOVA 分析。MrBayes 3.1.2 結合 Modeltest 3.7 構建貝葉斯系統進化樹。

2 結果

2.1 核苷酸組成

獲得黑尾近紅鲌nd5 基因序列長度為1 668 bp。如表2所示，nd5 基因序列總體變異率為0.30%，其中，長江干流HJ 群體的變異率高于支流。89 條序列間存在2 個簡約信息位點，3 個單一信息位點和2個插入/缺失位點，各群體堿基組成表現出明顯的A+T 偏倚性（56.4%）。

表2 黑尾近紅 鲌nd5 核苷酸序列特征Table 2 Sequence characteristics of nd5 in A.nigrocauda

2.2 遺傳多樣性分析

由表3可知，黑尾近紅鲌整體呈現低單倍型多樣性（h）和低核苷酸（π）的特點，其中，LAR 群體的單倍型多樣性最高（0.662），HJ 群體的單倍型多樣性最低（0.571）；HJ 群體核苷酸多樣性最高（0.000 69），LOR 群體最低（0.000 45）。如圖2所示，基于 nd5 序列共檢測到6 個單倍型，HJ 群體所特有的單倍型數目最多，Hap-1 為3 個地理群體共享單倍型，Hap-2為LAR 群體與HJ 群體共享，其他單倍型為單個群體所特有。

表3 黑尾近紅 鲌nd5 基因遺傳多樣性參數Table 3 Genetic diversity indices of nd5 in A.nigrocauda populations

圖2 黑尾近紅鲌nd5 單倍型分布圖Figure 2 Haplotypes distribution in A.nigrocauda populations based on mitochondrial nd5 sequences.

2.3 群體遺傳結構分析

遺傳分化系數的結果顯示，黑尾近紅鲌兩兩群體間的 Fst值（0.055 54～0.448 28）差異顯著（P＜0.01，表4）。LOR-LAR 群體間的 Fst值最大，LOR-HJ 群體間的 Fst值最小（表4），這表明 LOR 群體與 HJ 群體間的遺傳關系較近。LOR 群體與HJ 群體間的基因流較大（Nm＞1），LAR 群體與 LOR 和 HJ 群體間的基因流較小（Nm＜1），這表明 LOR 群體和 HJ 群體存在明顯的基因交流。分子變異方差分析（AMOVA）表明，分子變異主要來自群體內部（76.12%，表5）。

基于nd5 基因序列構建的系統發育進化樹顯示，盡管有少數黑尾近紅鲌個體的聚類與他們的地理來源不一致，但大部分個體仍是按照他們的地理來源聚類（圖3）。

3 討論

本研究中黑尾近紅鲌3 個群體的單倍型多樣性（0.412）和核苷酸多樣性（0.000 27）均低于Liu H.Z.等[11]和劉春池等[5]在龍溪河、習水河和木洞河的研究結果，同時也表現出兩個支流群體（LOR 和LAR）的單倍型數量和核苷酸多樣性均顯著低于干流群體（HJ，表3）。棲息地破壞、過度捕撈和修建人工水壩等人為活動是造成魚類遺傳多樣性、遺傳結構不可逆轉性惡化的主要因素[14-15]，這可能是黑尾近紅鲌遺傳多樣性水平下降的主要原因。3 個黑尾近紅鲌種群的棲息環境相差較大，長江干流水流量大，河流形態、生態環境、水生生物多樣性和河流連續性均優于支流[16-17]，支流生態環境的脆弱，過度捕撈、環境污染等人為干擾對其種群數量所產生的影響較大。近年來黑尾近紅鲌野生資源量呈急劇下降的趨勢，種群數量的銳減可能是導致遺傳多樣性快速丟失的主要原因。

表4 黑尾近紅 鲌群體內遺傳距離（對角線，粗體）、群體間遺傳距離（對角線下）和遺傳分化系數F（st對角線上）Table 4 Genetic fixation index (Fst) (above diagonal) and genetic distance within (diagonal)and between (below diagonal) A.nigrocauda populations

表5 黑尾近紅 鲌群體分子變異分析結果Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the A.nigrocauda populations

圖3 黑尾近紅鲌nd5 基因Bayes 系統進化樹Figure 3 Phylogenetic trees of the nd5 sequence of A.nigrocauda reconstructed with Bayesian inference.

淡水魚類種群很容易受棲息地環境改變、水體污染、水利水電工程的修建和外來物種入侵等因素的影響，從而導致生物多樣性下降[18-20]。近年來，在遼河修建了很多引水工程，雖然短期內對魚類群體沒有影響，但長期以來會導致瀕危物種生物多樣性降低甚至滅絕[20]。本研究結果結合先前的研究結果表明[5，11]，在最近 10 多年，研究區域內黑尾近紅鲌的遺傳多樣性下降明顯。龍溪河和瀨溪河是黑尾近紅鲌的主要棲息地，他們分別是長江和沱江的一級支流，水利水電設施的修建使得支流中的黑尾近紅鲌與長江干流群體僅能進行單向的基因交流。同時，龍溪河與瀨溪河流經的城鎮較多，魚類棲息環境受生活污染、工農業生產等人類活動的影響較大[4，11，21]，遺傳多樣性丟失的速度更快。

遺傳分化分析結果表明，3 個種群間存在顯著的遺傳分化（0.055 54～0.448 28，表4），群體內的變異程度高于群體間（表5）。黑尾近紅鲌產粘性卵，受精卵就地孵化發育，幼魚和成魚沒有長距離遷移特性，黑尾近紅鲌的這些特性可能有助于地理種群間的遺傳分化。但是，HJ 群體與 LOR、LAR 群體的取樣地分別相距大約82 km 和126 km，如此短的地理距離，黑尾近紅鲌的產卵習性等是否是其種群間出現遺傳分化的主要原因，還待進一步確認。此外，在龍溪河和瀨溪河上分別建有7 個和5 個人工大壩，并且這些大壩最早建于20 世紀20年代，嚴重阻礙了黑尾近紅鲌群體間的基因交流，特別是向上基因交流已不可能，因此人工大壩可能也是導致這些種群分化的一個重要原因。從目前的大壩分布情況來看，LOR 群體和LAR 群體可以向下與HJ 群體進行基因交流，但LOR 群體和LAR 群體間幾乎完全阻隔，并且LOR 群體和LAR 群體之間的Fst值最大，這也反映了大壩目前的阻隔形勢嚴峻。同時，支流小種群間的遺傳漂變和快速的基因丟失也可能加速了種群間的遺傳分化[22]。但是，這些大壩的阻隔并不完全，3 個種群間存在一定程度的基因交流（表4），比如支流向下單向基因交流必然存在，同時大壩阻隔時間還相對較短，因此系統進化分析中，少數個體并沒有與其自身地理種群聚類（圖3）。

綜上所述，長江上游黑尾近紅鲌群體的遺傳多樣性下降明顯，急需對其開展保護工作。雖然干流群體表現出較高的單倍型多樣性水平，在黑尾近紅鲌群體的遺傳保護中扮演了重要角色，但是支流種群具有種群特有的單倍型，且與干流種群的遺傳多樣性水平差異顯著，同時，支流群體能對干流種群形成較好的資源補充。因此，本研究認為干流和支流都應是黑尾近紅鲌重要的保護單元。