三聚氰胺致貓慢性腎衰模型的建立

李嫣然，左之才，黃方園

（四川農業大學動物醫學院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

貓慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是由原發或繼發腎臟病引起，導致承擔腎功能的腎單位絕對數減少70%以上，由此產生的各種臨床癥狀和代謝紊亂所組成的癥候群，其對腎臟損害具有漸進性、不可逆性[1-2]。據統計，慢性腎功能衰竭為貓最大的腎臟疾病，是導致貓死亡的第二大因素，10歲以上的貓患慢性腎衰比例約45%，且臨床雄貓、雌貓發病比率接近1.06∶1，無明顯性別差異[3]。引起貓CRF 的原因很多，一般認為其與年齡、遺傳因素、飲食、環境和腎臟疾病有關，也可由急性腎功能衰竭轉化而來[4-5]。目前，由于貓CRF 的發病機制復雜，其病因不明。加之國內相關研究較少，臨床上基本沒有特效治療藥物，僅能通過食物療法以及適當的對癥治療來減輕腎臟的負擔[6-8]，故探尋一種適合于貓的CRF 動物模型很有必要。

自2007年“美國寵物毒糧事件”[9]以來，三聚氰胺因其高含氮量被非法商販作為添加劑以提高貓糧中蛋白質檢測數值，導致臨床上大量寵物貓因三聚氰胺中毒致腎衰死亡，引起各界廣泛關注。研究表明，三聚氰胺本身無毒或微毒[10-11]，但當三聚氰胺與其同系物混合時，形成的三聚氰胺-三聚氰酸鹽在尿中溶解度低，造成結石損傷腎臟，引起腎衰，而對其他組織器官毒害作用小[12]。故本試驗根據貓的生理代謝特性和三聚氰胺對貓腎臟毒害作用，建立貓慢性腎衰竭模型，為研究貓CRF 發病機理，篩選有效藥物，闡明療效機制提供有效模型基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

取2～4 周歲健康成年貓30 只（雅安市某流浪貓中心），雌雄不限，體重 2～4.5 kg，適應性飼養 3～5 d。

1.1.2 試驗試劑及儀器

材料：三聚氰胺（純度＞99%）（購自國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170306）、三聚氰酸（純度＞98%）（購自國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160203）。

儀器：自動干式生化分析儀（愛科來醫療電子有限公司，型號：SP-4430）、全自動血細胞分析儀（深圳市普康電子有限公司，型號：PE-6800VET）、尿液分析儀（愛科來醫療科技有限公司，型號：RT-4010）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組

將30 只健康試驗貓隨機分為4 組（見表1），設高劑量組（Ⅰ組，n=8）、中劑量組（Ⅱ組，n=8）、低劑量組（Ⅲ組，n=8）和空白對照組（Ⅳ組，n=6)飼喂三聚氰胺與三聚氰酸1∶1 混合物。試驗組飼喂：將上述兩種試劑等比混合物按上述劑量用少量食用油溶解，摻入少量貓糧飼喂后，按正常貓食量添加貓糧和清潔飲用水，連續21 d，后再按1 次/兩日飼喂14 d（7次）；試驗期間空白對照組飼喂相同貓糧，各組不限飲水；同條件環境下飼養（分組見表1）。

表1 試驗貓分組給藥Table 1 Grouping of experimental cats mg·kg-1

1.2.2 動物基本情況觀察

造模期間，定時觀察并記錄各組試驗貓行為變化、生長情況、死亡情況、尿量變化等，直至試驗結束。

1.2.3 血液生理生化檢查

于 0、22、36 d 對各組活體用 5 mL 的真空采血管通過前肢靜脈（采血前12 h 不喂食）采集血液2.5 mL，其中0.5 mL 血液加入抗凝管中；檢測血肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）、紅細胞計數（RBC）、紅細胞壓積（HCT）等指標。

1.2.4 尿常規檢查

于0、22、36 d 通過膀胱穿刺法采集各組活體尿液1 mL，用尿液分析儀檢測尿比重（SG）、蛋白質（PRO）等指標。

1.2.5 病理組織切片制作及觀察

造模期間，對死亡貓及時進行解剖觀察，采集病理組織（腎臟）制作病理組織切片，進行固定、石蠟包埋、切片、HE 染色、光鏡病理組織學檢查。

1.2.6 貓慢性腎衰模型建立的標準

參考國際腎臟權益組織(IRIS)貓慢性腎衰分級標準[13]，試驗將血清肌酐濃度作為判斷貓腎衰程度的指標。當臨床表現多尿，輕度脫水、貧血，檢測肌酐濃度為 140～250 μmol/L，判定為輕度腎衰（失代償）；臨床表現少尿，中度或重度貧血，酸中毒，肌酐濃度 250～440 μmol/L，判定為中度腎衰（氮質血癥）；臨床表現無尿，明顯嗜睡、尿中毒癥狀，肌酐濃度大于440 μmol/L，判定為重度腎衰（尿毒癥）。

1.3 數據處理

采用Excel 軟件和SPSS22.0 軟件對各試驗數據進行統計分析，數據以均數±標準差（±SD）的形式表示，P＜0.05 為差異顯著，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 三聚氰胺與三聚氰酸對貓臨床癥狀表現的影響

高劑量組貓于14 d 出現多飲多尿，食欲下降；20 d 時，多數貓的精神沉郁，少尿，活動減少，蜷縮成一團；28 d 時，其中兩只貓出現食欲廢絕，口臭，被毛粗亂，消瘦，嚴重脫水，精神高度沉郁，黏膜蒼白，并分別在 30、32 d 死亡，其他貓在 33～34 d 表現精神萎靡，被毛粗亂，消瘦，脫水。中劑量組貓在造模前期基本無明顯臨床變化，在23 d 出現明顯多飲多尿，食欲下降，精神沉郁（活動量減少），輕度脫水至中度脫水，黏膜蒼白、貧血，消瘦等癥狀。低劑量組貓在32 d 前的精神、食欲和行為無明顯變化，在32 d后出現輕微多飲多尿。對照組無任何臨床癥狀。

2.2 三聚氰胺與三聚氰酸對貓體重的影響

試驗 0 d，各組體重差異不顯著（P＞0.05）；22 d，Ⅰ組貓體重顯著低于Ⅳ組（P＜0.05）；36 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組體重顯著低于Ⅳ組（P＜0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組貓體重在22、36 d 均有所下降，但差異均不顯著（P＞0.05），Ⅳ組貓體重略有上升（P＞0.05）（見表2）。本試驗結果顯示，三聚氰胺與三聚氰酸可引起貓體重下降。

2.3 三聚氰胺與三聚氰酸對貓血清腎功能指標的影響

試驗0 d，各組貓的血肌酐差異不顯著（P＞0.05）；22 d 時，Ⅰ組貓血肌酐含量顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組（P＜0.05）；36 d 時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組貓血肌酐含量顯著高于Ⅳ組（P＜0.05），且隨藥物劑量增大升高越顯著。組內不同時間相比較，Ⅰ組貓22、36 d 的血肌酐含量顯著高于0 d（P＜0.05）；Ⅱ組、Ⅲ組貓血肌酐含量于0、22、36 d 隨時間增加而顯著升高（P＜0.05）；Ⅳ組貓血肌酐含量隨時間無顯著變化（P＞0.05）（見表3）。可見，貓血肌酐含量可隨喂三聚氰胺、三聚氰酸時間的增加而升高，且隨劑量的增大而升高更顯著。

試驗0d，各組貓尿素氮含量無顯著差異（P＞0.05）；造模22 d 時，Ⅰ組、Ⅱ組貓尿素氮顯著高于Ⅳ組（P＜0.05），Ⅲ組與Ⅳ組貓尿素氮含量無顯著差異（P＞0.05）；36 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組貓尿素氮含量均顯著高于Ⅳ組（P＜0.05），其中，Ⅰ組與Ⅱ組無顯著差異（P＞0.05）。組內不同時間相比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組貓于22、36 d 的尿素氮含量均顯著高于0 d（P＜0.05），且隨時間增加而升高（見表3）。貓尿素氮隨喂三聚氰胺、三聚氰酸時間的增加可顯著升高，且與劑量正相關。

綜上結果，三聚氰胺與三聚氰酸對貓血清肌酐、尿素氮的影響變化趨勢是隨著劑量的增加和飼喂時間的延長而顯著升高。

表2 三聚氰胺及三聚氰酸致貓CRF 模型體重比較（±SD）Table 2 Weight comparison of cat CRF models Induced by mlamine and cyanuric acid（±SD） kg

表2 三聚氰胺及三聚氰酸致貓CRF 模型體重比較（±SD）Table 2 Weight comparison of cat CRF models Induced by mlamine and cyanuric acid（±SD） kg

注：*Ⅰ組貓于 30 d、32 d 死亡兩只，故 36 d 時 n=6；標有不同大寫字母的數據之間差異顯著（P＜0.05），右下標表示同時間點組間相比，右上標表示組內不同時間點相比。下表同。Note：*Because the two cats in group Ⅰ died on 30 d and 32 d，there were 6 cats lef on 36 d；Data with different capital letters differ significantly（P＜0.05），the right subscript represents the comparison between groups of time points，and the right superscript represents the comparison between groups of different time points.The same as below.

時間TimeⅠ組（n=8*）Group ⅠⅡ組（n=8）Group ⅡⅢ組（n=8）Group ⅢⅣ組（n=6）Group Ⅳ3.77±0.41AA 3.84±0.45BA 3.98±0.41BA 0 d 22 d 36 d 3.46±0.57AA 3.21±0.68AA 3.31±0.25AA 3.59±0.33AA 3.47±0.33ABA 3.31±0.34AA 3.40±0.46AA 3.36±0.43ABA 3.32±0.44AA

2.4 三聚氰胺與三聚氰酸對貓血液生理指標的影響

試驗0 d，各組貓RBC 處于正常范圍，無顯著差異（P＞0.05）；22 d，Ⅱ組貓 RBC 顯著低于Ⅳ組（P＜0.05），Ⅰ組、Ⅲ組與Ⅳ組無顯著差異（P＞0.05）；36 d，Ⅰ組、Ⅱ組貓RBC 顯著低于Ⅲ組與Ⅳ組（P＜0.05）。Ⅰ組、Ⅱ組貓于 36 d 的 RBC 顯著低于 0 d（P＜0.05），Ⅲ組與Ⅳ組0、22、36 d 隨時間變化無顯著差異（P＞0.05）。Ⅰ組、Ⅱ組貓RBC 隨時間不斷降低，而Ⅲ組并未降低。表明貓RBC 隨三聚氰胺、三聚氰酸劑量的加大而降低（見表4）。

0 d 時，各組貓 HCT 差異不顯著（P＞0.05）；22 d，Ⅰ組顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組（P＜0.05）；36 d，Ⅰ組、Ⅱ組均顯著高于Ⅲ組、Ⅳ組（P＜0.05）。Ⅰ組貓22、36 d的 HCT 顯著高于 0 d（P＜0.05），Ⅱ組于 36 d 時顯著高于 0、22 d（P＜0.05）；Ⅲ組、Ⅳ組貓 0、22、36 d 各時間點的 HCT 無顯著差異（P＞0.05）。可知，Ⅰ組、Ⅱ組HCT 均隨時間顯著升高，并超出正常范圍（見表4）。

由此可見，貓RBC 的降低與HCT 的升高均需要三聚氰胺與三聚氰酸達到一定劑量水平的刺激，才會發生，且劑量越大，其RBC 下降、HCT 升高越顯著。

2.5 三聚氰胺與三聚氰酸對貓尿生化指標的影響

0 d 時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組尿比重與Ⅳ組無顯著差異（P＞0.05），22 d，Ⅰ組、Ⅱ組尿比重水平顯著低于Ⅲ組、Ⅳ組（P＜0.05），36 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組尿比重均顯著低于Ⅳ組（P＜0.05）。相比 0 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組 36 d 時尿比重均顯著下降（P＜0.05），且Ⅰ組、Ⅱ組相比Ⅲ組下降更迅速。可知尿比重的變化，除Ⅰ組先下降后稍升高外，Ⅱ組、Ⅲ組均隨時間持續下降（見表5）。

0 d 時，各組貓尿蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）；22 d，Ⅰ組、Ⅱ組尿蛋白顯著高于Ⅲ組、Ⅳ組（P＜0.05），且Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05）；36 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組尿蛋白顯著高于Ⅳ組（P＜0.05）。Ⅰ組、Ⅱ組 22 d、36 d 尿蛋白含量顯著高于 0 d（P＜0.05），Ⅲ組 36 d 尿蛋白顯著高于 0、22 d（P＜0.05），Ⅳ組無變化（P＞0.05）。Ⅰ組尿蛋白升高迅速，之后稍有下降，而Ⅱ組、Ⅲ組隨時間持續穩定上升（見表5）。

表3 三聚氰胺與三聚氰酸致貓CRF 模型血清腎功能指標比較（±SD）Table 3 Comparison of serum renal function indexes of cat CRF model induced by melamine and cyanuric acid（±SD）

表3 三聚氰胺與三聚氰酸致貓CRF 模型血清腎功能指標比較（±SD）Table 3 Comparison of serum renal function indexes of cat CRF model induced by melamine and cyanuric acid（±SD）

指標Indicators時間TimeⅠ組（n=8*）Group ⅠⅡ組（n=8）Group ⅡⅢ組（n=8）Group ⅢⅣ組（n=6）Group ⅣCRE/（μmol·L-1）BUN/（mmol·L-1）0 d 22 d 36 d 0 d 22 d 36 d 92.13±15.88AA 405.13±266.17BB 429.33±26.23DB 8.80±1.45AA 24.24±10.39CB 25.98±1.14CB 89.25±11.44AA 230.00±53.31AB 323.88±59.24CC 8.31±1.25AA 16.85±2.54BB 26.29±4.13CC 88.25±11.37AA 141.00±10.81AB 173.50±15.06BC 7.73±0.93AA 13.83±1.75ABB 15.38±1.10BC 86.53±13.90AA 93.53±12.13AA 87.27±11.35AA 8.19±1.32AA 8.55±1.12AA 8.35±1.04AA

表4 三聚氰胺與三聚氰酸致貓CRF 模型血生理指標比較（±SD）Table 4 Comparison of blood physiological indexes of cat CRF model induced by melamine and cyanuric acid（±SD）

表4 三聚氰胺與三聚氰酸致貓CRF 模型血生理指標比較（±SD）Table 4 Comparison of blood physiological indexes of cat CRF model induced by melamine and cyanuric acid（±SD）

指標Indicators時間TimeⅠ組（n=8*）Group ⅠⅡ組（n=8）Group ⅡⅢ組（n=8）Group ⅢⅣ組（n=6）Group ⅣRBC/（1012 個·L-1）HCT/%0 d 22 d 36 d 0 d 22 d 36 d 5.92±0.73AB 5.03±1.48ABB 3.80±0.46AA 32.9±4.5AA 46.0±13.7BB 54.8±7.2BB 5.62±0.64AB 4.80±0.40AA 4.26±0.54AA 31.3±2.6AA 32.1±10.5AA 51.1±6.9BB 5.54±0.46AA 5.42±0.77ABA 5.88±1.15BA 31.7±2.6AA 30.2±5.8AA 31.9±6.3AA 6.00±0.76AA 6.03±0.66BA 6.21±0.80BA 32.5±2.7AA 33.7±1.8AA 34.5±1.6AA

表5 三聚氰胺與三聚氰酸致貓CRF 模型尿生化指標比較（±SD）Table 5 Comparison of urinary biochemical indices of cat CRF model induced by melamine and cyanuric acid（±SD）

表5 三聚氰胺與三聚氰酸致貓CRF 模型尿生化指標比較（±SD）Table 5 Comparison of urinary biochemical indices of cat CRF model induced by melamine and cyanuric acid（±SD）

指標Indicators時間TimeⅠ組（n=8*）Group ⅠⅡ組（n=8）Group ⅡⅢ組（n=8）Group ⅢⅣ組（n=6）Group Ⅳ尿比重尿蛋白/（mg·dL-1）0 d 22 d 36 d 0 d 22 d 36 d 1.040±0.005BB 1.019±0.009AA 1.024±0.004BA 0.0±0.0AA 26.3±6.9CB 20.0±7.7BB 1.037±0.003ABB 1.018±0.006AA 1.017±0.004AA 0.0±0.0AA 15.0±11.3BB 16.9±12.5BB 1.035±0.003AC 1.031±0.003BB 1.022±0.004BA 0.0±0.0AA 5.6±7.8AA 18.8±6.9BB 1.037±0.002ABA 1.036±0.001BA 1.037±0.003CA 0.0±0.0AA 0.0±0.0AA 0.0±0.0AA

由此可見，三聚氰胺與三聚氰酸可引起貓尿比重下降、產生尿蛋白，且劑量越高其尿比重下降、尿蛋白升高越顯著。

2.6 三聚氰胺與三聚氰酸建立貓慢性腎衰模型成功情況

試驗結束時，參考國際腎臟權益組織（IRIS）貓慢性腎衰分級標準，判定Ⅰ組貓中度腎衰4 只（50%）、重度腎衰 2 只（25%）、死亡 2 只（25%），成功率 75%。Ⅱ組貓輕度腎衰1 只（12.5%）、中度腎衰7 只（87.5%），成功率100%。Ⅲ組貓輕度腎衰8 只（100%），成功率100%。Ⅳ組貓全為健康（100%）（見表6）。據表統計所知，三聚氰胺與三聚氰酸用量越大，對貓腎臟造成的損傷越嚴重，且易致死亡。

表6 三聚氰胺與三聚氰酸建立貓CRF 模型成功率Table 6 Success rate of establishing cat CRF model with melamine and cyanuric acid %

圖1 高劑量組死亡貓腎臟病理學觀察Figure 1 Histopathological observation of kidney of dead cats in high dose group

2.7 死亡貓病理組織學檢查結果

高劑量組死亡貓剖檢可見腎臟呈白色，稍腫大。組織病理學觀察可見（圖1A，B），腎臟組織被膜完整，略有增厚；腎臟結構呈彌漫凝固性壞死，腎小球腫大變性、球內血管袢結構破壞、系膜細胞以及足細胞溶解脫落、腎小囊內可見脫落的一些碎片組織和絮狀或顆粒樣物質。腎小管上皮細胞空泡變性、壞死，細胞脫落在管腔中央形成腎小管上皮細胞管型，管腔內可見蛋白樣物質沉積，壞死周圍部分管腔不規則彎曲變性，腎小管中未見晶體出現。

3 討論與結論

貓慢性腎衰的發病率為9.6%，其中12 歲以上貓CRF 發病率為28%，15 歲以上貓發病率為30%[14]。貓慢性腎功能衰竭是指腎小球損傷，腎小球濾過率下降，腎代謝紊亂的綜合征[15]。隨著生活水平的提高，臨床病例中老齡貓的比例顯著升高，而腎衰竭是老齡貓臨床多發的主要代謝疾病。在我國，10 歲以上患慢性腎衰的犬約有20%，而10 歲以上患病的貓則約有45%[16]，其原因主要與貓的身體結構以及飲食習慣有關。貓單側腎臟的腎單位是20 萬，數量僅為犬的一半[17]，當動物雙側腎單位功能喪失約75%時就會發生腎衰竭；且貓作為肉食性動物其日常所需蛋白含量是其他雜食性動物的4～5 倍，高蛋白飲食可增加腎功能負擔，加重慢性腎衰的進程[18]。另有資料顯示，2007年3月至今，已有4 000 多起貓、狗等寵物因三聚氰胺中毒而腎衰死亡的案例，對寵物行業造成巨大損失[19]。由于CRF 發病機制復雜，臨床對于該病的治療僅能通過保守療法延緩腎衰的發展進程。因此建立貓慢性腎衰模型，對研究貓CRF 發病機理，篩選有效藥物，闡明療效機制有重要作用。

目前，腎大部切除法和0.75%腺嘌呤飲食是建立慢性腎衰模型常用的兩種方法。腎大部切除法普遍需要較強的技術性，并且周期長，手術標準化不高，模型動物易出現應激、厭食和死亡率高等缺點[20]；0.75%腺嘌呤飲食受藥物劑量、用藥周期和動物類別差異影響較大，導致對腎臟損害程度不好把握，同時又會對其他組織器官產生較強毒性[21]。故本研究采用三聚氰胺與三聚氰酸混合飼喂的方式建立貓慢性腎衰模型。據報道，貓大量或長期攝入一定劑量的三聚氰胺會產生腎結石，引起腎功能衰竭，且三聚氰胺主要對泌尿系統尤其是腎臟造成損害，而對其他組織器官毒害作用小[11，22]。如R.E.Cianciolo等對2007年死于三聚氰胺污染的貓剖檢發現，三聚氰胺主要對腎造成損害，腎組織病理檢查見腎小管壞死伴增生，管內有大量結晶以及腎間質纖維化和炎性細胞浸潤[23]。在本試驗中，死亡貓組織病理學觀察可見腎小球腫大變性，腎小管形成上皮細胞管型，管內蛋白質沉積，管腔不規則彎曲變性，而腎小管內未見有結晶出現，與李翠枝等[24]的結果較一致，分析其原因可能是腎臟中三聚氰胺濃度尚不足以形成可見晶體沉積于腎小管。

本研究采用高（20 mg/kg）、中（10 mg/kg）、低（5 mg/kg）劑量的三聚氰胺與三聚氰酸混合物飼喂貓5 周后，造模組貓血肌酐、尿素氮升高，紅細胞下降、紅細胞壓積升高，尿比重下降、尿蛋白升高；臨床表現為被毛粗亂、多飲多尿、后少尿、精神食欲下降、逐漸消瘦、貧血脫水、口臭等癥狀，與臨床貓CRF 相關研究表現一致[1]。目前建立慢性腎衰動物模型的關鍵是損傷腎臟并持續發展惡化，同時保證較低的死亡率[25]。本研究中，高劑量組貓在試驗中期便出現明顯腎衰表現，并在后期死亡2 只，其發展進程較快，死亡率較高，未能建立穩定的慢性腎衰模型；而中、低劑量組貓腎衰表現是于試驗后期呈進行性出現的，且未有貓死亡，其血、尿生理生化指標較高劑量組指標進展更為穩定，故中、低劑量組為成功建立的穩定的貓CRF 模型。采用此方法建立的貓CRF 動物模型不僅試驗周期短、操作簡單、可重復性高，且克服了藥物法對試驗動物其他組織產生較強毒性，死亡率高等缺點。此外，選用貓作為試驗動物具備良好的臨床相似性。不過該法也存在不足之處，如貓作為試驗動物成本較高以及雄貓較雌貓更易發生腎結石而致試驗結果受到影響。

綜上，本研究通過三聚氰胺與三聚氰酸混合飼喂的方式成功建立了穩定的貓慢性腎衰竭模型，為研究貓慢性腎功能衰竭致病機理及臨床治療藥物的篩選奠定基礎。