低溫脅迫對玉米轉綠過程中葉綠素生物合成的影響

毛晶晶，李澤嬌，趙雨晴，袁 澍，袁 明*

（1.四川農業大學生命科學學院，四川雅安 625014；2.四川農業大學資源學院，成都 611130）

在黑暗或光照條件下，被子植物原質體發育形成黃化質體的過程稱為暗形態建成（skotomorphogenesis）或黃化作用；相反，在光照條件下植物幼苗前質體或黃化質體發育成葉綠體的過程稱為光形態建成（photomorphogenesis）[1-2]。轉綠（greening）就是指植物幼苗從暗形態建成向光形態建成轉變的過程[3-4]，葉綠素合成是該過程中最重要的生理生化反應[1-2]。

葉綠素 a（chlorophyll a，Chl a）和葉綠素 b（chlorophyll b，Chl b）在光合作用中的功能是捕獲光能并驅動電子轉移[5]，對植物的生長發育及作物產量具有極其重要的作用。植物葉綠素生物合成是一個復雜且高度有序的過程，主要包括3 個部分：四吡咯代謝共同途徑、鎂分支途徑和葉綠素循環途徑[5]。四吡咯代謝共同途徑中間產物包括：δ-氨基乙酰丙酸（δ-aminolevulinic acid，ALA）、單卟啉膽色素原（porphobilinogen，PBG）、尿卟啉原Ⅲ（uroporphyrinogen Ⅲ，Urogen Ⅲ）、糞卟啉原Ⅲ（coproporphyrinogenⅢ，Coprogen Ⅲ）、原卟啉原Ⅸ（protoporphyrinogen，Protogen Ⅸ）和原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，ProtoⅨ）[5]；鎂分支途徑中的中間產物包括：Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-protoporphyrin Ⅸ，Mg-proto Ⅸ）、Mg-原卟啉甲酯（Mg-protoporphyrin methyl ester，Mpe）、Mg-原卟啉Ⅸ二酯（Mg-protoporphyrin Ⅸ dimethyl ester，Mpde）、原葉綠素酸酯 a（protochlorophyllide，Pchlide a）和葉綠素酸酯 a（chlorophyllide a，Chlide a）[5]；葉綠素循環主要包括Chl a 和Chl b[5]。Proto Ⅸ處還分出另一條合成亞鐵血紅素（heme）和光敏色素的途徑[6]。葉綠素生物合成過程易受外界環境影響，溫度就是重要影響因子之一，低溫可能導致合成過程中的某些關鍵酶活性降低甚至喪失，阻礙葉綠素合成和葉綠體發育，導致植物生長遲緩、發育不良甚至死亡[7]。

玉米[8]、黃瓜[9-10]、小麥[10]、青松[11]、水稻[12]等植物在去黃化過程中，鹽脅迫、水分脅迫、干旱脅迫、低溫或高溫脅迫均可下調葉綠素代謝相關基因的表達或影響一些酶的翻譯后修飾，導致葉綠素合成的相關酶活性均下降，影響葉綠素合成的前體物質ALA、Mpe、Pchlide 含量，導致葉綠素含量降低，影響植物的代謝、生長、光合作用以及產量[12]。玉米（Zea mays L.）是喜溫的禾本科一年生C4 植物，是全世界種植面積最大的作物種類之一，是重要的糧食作物、飼用作物和工業原料作物，在我國農業乃至國民經濟中占有重要地位[13]。玉米最適生長溫度介于25 ℃到28 ℃之間，在早春播種的玉米經常遭受春季低溫（10～18 ℃）脅迫，種子萌發和幼苗生長均受到影響，甚至造成大面積缺苗，最終顯著降低產量[13]。因此，研究低溫對玉米轉綠過程中葉綠素合成的影響具有重要的理論意義和應用價值。

本研究通過對14 ℃（取10～18 ℃中間值）低溫脅迫下玉米幼苗轉綠過程中葉綠素合成中間產物的分析，探究轉綠過程中低溫影響葉綠素合成的具體步驟，為進一步探討低溫脅迫調控高等植物葉綠素合成的機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料及處理方法

玉米種子福玉一號購于種衍種業股份有限公司。挑選顆粒飽滿完整的玉米種子，用蒸餾水浸種8 h 后，于25 ℃黑暗下催芽48 h。將發芽的種子移栽至土壤（營養土∶黏土=1 ∶1）中在黑暗下培養6 d。將所有的植株隨機平均分為兩組，每組36 株。一組置于玉米最適生長溫度25 ℃，人工光照120 μmol/（m2·s）見光48 h；另一組置于低溫脅迫14 ℃，人工光照120 μmol/（m2·s）見光48 h。分別測定見光前、25 ℃見光48 h 和14 ℃見光48 h 植株的第二片葉葉綠素合成途徑11 項中間產物及血紅素共12 項指標。

1.2 研究指標與方法

1.2.1 葉綠素及血紅素含量測定

葉綠素含量測定參照Guo X.等[14]的方法，采用80%丙酮提取色素，并用紫外分光光度計測定葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b 及其比值。血紅素含量測定參照O.Czamacki[15]等的方法，采用丙酮-二甲亞砜-濃鹽酸，乙醚萃取，紫外分光光度計測定。

1.2.2 葉綠素前體物質含量測定

δ-氨基乙酰丙酸含量測定參照楊清等[16]的方法，4%三氯乙酸提取，Ehrlich-Hg 試劑顯色，紫外分光光度計法測定。膽色素原含量測定參照陳凌艷等[17]的方法，采用Tris-EDTA 緩沖液提取，Ehrlich-Hg 試劑顯色，紫外分光光度計法測定。尿卟啉原Ⅲ和糞卟啉Ⅲ含量測定參照董立花等[18]的方法，尿卟啉原Ⅲ采用磷酸緩沖液（pH 6.8）提取，紫外分光光度計法測定；糞卟啉Ⅲ采用磷酸緩沖液（pH 6.8）提取，0.1 mol/L 的鹽酸萃取，紫外分光光度計法測定。原卟啉Ⅸ含量測定參照舒華等[19]的方法，采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷萃取，熒光分光光度計法測定。

鎂原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯和鎂原卟啉Ⅸ二酯含量測定參照舒華等[19]的方法，采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷萃取，Mg-Proto Ⅸ和Mpe 存在于下相丙酮液中，熒光分光光度計法測定Mg-ProtoⅨ和Mpe 的共同熒光強度；采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷、乙醚分別依次萃取，從而計算出Mpe的相對含量；Mpde 存在于上述步驟烷相中，將烷相在真空低溫干燥箱中干燥后溶于80%丙酮，熒光分光光度計法測定其相對含量。原葉綠素酸酯和葉綠素酸酯含量測定參照董立花等[18]的方法，熒光分光光度計測定相應的熒光強度。

1.3 數據分析

所有試驗均重復3 次，試驗數據用Excel 2007 整理，用 SPSS 19.0 進行 LSD 顯著性差異分析（P＜0.05），用Origin Pro 9.0 進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對四吡咯代謝共同途徑的影響

與未見光相比，見光 48 h 后，25 ℃下 ALA 含量顯著下降，但是14 ℃低溫下ALA 含量卻略有上升（圖1），說明光照和溫度都是影響ALA 含量的重要因子。見光 48 h 后，PBG、Urogen Ⅲ和 CoprogeⅢ的積累量均升高；14 ℃低溫處理的幼苗的PBG、Urogen Ⅲ和Coproge Ⅲ含量均低于25 ℃處理組；說明低溫抑制見光幼苗的PBG、Urogen Ⅲ和CoprogeⅢ的積累。Proto Ⅸ是葉綠素和血紅素生物合成的最后一個共同中間產物，見光48 h 后，Proto Ⅸ含量均顯著下降，尤其是14 ℃低溫條件下。與常溫轉綠相比，低溫轉綠過程中ALA 積累較高，而PBG、UrogenⅢ、Coproge Ⅲ和Proto Ⅸ含量均低于常溫，說明ALA 向PBG 的轉化可能受到低溫抑制。

2.2 低溫脅迫對鎂分支途徑的影響

光照48 h 后，Mg-proto Ⅸ和Mpe 含量均上升，但是14 ℃低溫脅迫下Mg-proto Ⅸ積累量較25 ℃更高，而Mpe 含量較25 ℃低（圖2），說明低溫可能抑制Mg-proto Ⅸ向Mpe 進一步轉化。見光后Mpde 含量均顯著下降，且14 ℃和25 ℃處理組無顯著差異。Pchlide 和Chlide 見光后含量均顯著下降，在14 ℃低溫脅迫下更低。低溫脅迫可能抑制鎂分支途徑的Mg-proto Ⅸ向Mpe 的轉化，從而導致后續產物Pchlide 和 Chlide 含量較 25 ℃更低。

2.3 低溫脅迫對葉綠素合成的影響

25 ℃常溫見光后，總葉綠素及葉綠素a、b 含量均急劇上升（圖3A）；但14 ℃低溫見光后，葉綠素含量與見光前相比變化不顯著，表明14 ℃低溫嚴重抑制葉綠素合成。25 ℃和14 ℃見光后的Chl a/Chl b 值分別為4.36 和1.99（圖3B），說明低溫可能對葉綠素a 向葉綠素b 的轉化也有抑制作用。

圖1 低溫脅迫對四吡咯代謝共同途徑中各個中間代謝物相對含量的影響Figure 1 Effect of low temperature on the relative contents of intermediate metabolites in the common pathway of tetrapyrrole metabolism

圖2 低溫脅迫對鎂分支途徑中各個中間代謝產物相對含量的影響Figure 2 Effect of low temperature on the relative content of intermediate metabolites in magnesium branching pathway

圖3 低溫脅迫對總葉綠素和葉綠素a、b 的相對含量（A）以及葉綠素a 與葉綠素b 比值的影響（B）Figure 3 Effect of low temperature on the relative content of total chlorophyll，chlorophyll a，chlorophyll b （A） and the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b （B）

2.4 低溫脅迫對血紅素合成的影響

血紅素與葉綠素合成有四吡咯代謝共同途徑，共用ALA 前體物質，且血紅素對ALA 的合成有反饋抑制作用[6]。本研究表明血紅素作為鐵分支的第一個產物，見光后，其積累量顯著上升，說明光能促進血紅素的合成。14 ℃低溫下血紅素積累量明顯低于25 ℃常溫下的積累量，說明低溫會抑制血紅素積累（圖4）。

圖4 低溫脅迫對血紅素相對含量的影響Figure 4 The effects of low temperature on on the relative content of heme

3 討論與結論

目前研究均表明光和溫度是影響葉綠素合成的重要環境因素。喻敏等發現低溫抑制葉綠素合成，導致其含量顯著降低[20]；另外，賈學靜在紅花木的研究中，認為溫度升高可能是紅花 檵木紅葉轉綠的關鍵因素，再次說明溫度對色素合成的重要性[21]。舒華等通過降低光照強度，使茶樹新梢葉綠素含量顯著增加；同時葉綠素生物合成的前體ALA、PBG、Urogen Ⅲ等含量降低，而Proto Ⅸ、Mg-ProtoⅨ、Pchlide 含量升高，說明光照也是影響葉綠素及其前體物質積累的重要因子之一[19]。董立花在寬葉吊蘭中發現，葉綠素生物合成受晝夜節律的調控[16]，推測可能是由于晝夜光照和溫度的差異導致；本研究的結果也表明光和溫度對葉綠素合成影響很大，且低溫顯著抑制葉綠素生物合成（圖3）。

初始前體物質ALA 的合成和鎂離子的插入步驟是植物葉綠素合成兩個關鍵調控點[22]，但是不同的環境因素對葉綠素合成途徑的影響是具有差異的。近幾年來，不少學者對不同現象進行分析，探討是葉綠素合成途徑中哪一具體步驟起作用，對葉綠素合成方面的研究進行補充。董立花發現在金心吊蘭的金心部分，葉綠素代謝途徑中存在3 個受阻位點：ALA、Proto Ⅸ和Pchlide 的合成，由于金心吊蘭金心部分在合成開始時ALA 已受到抑制，推測ALA 合成受阻可能是其形成黃色葉條紋的主要原因[23]；楊清等通過葉面噴施胺鮮脂（DA-6）提高ALA向PBG 轉化的效率，從而使葉綠素積累量增加[24]；S.Cenkci 等發現鉛導致蘿卜（Brassica rapa L.）幼苗葉片ALA 積累，ALA 脫水酶活性降低，光合色素含量下降，且變化程度呈劑量依賴關系[25]；本研究也發現在玉米轉綠過程中，低溫也會抑制ALA 向PBG 轉化（圖1），說明ALA 向 PBG 的轉化易受外界環境影響。Wu Y.等發現NaCl 脅迫下，黃瓜幼苗鐵螯合酶（HEMH）基因表達下調，血紅素積累降低[26]；本研究發現低溫也會抑制玉米轉綠過程中血紅素的積累（圖4），推測可能就是低溫抑制鐵螯合酶基因表達或者該酶活性導致的。喻敏等發現低溫抑制冬小麥Chl a 向Chl b 的轉化，導致葉綠素合成受阻[20]；本研究發現低溫也抑制玉米轉綠過程中Chl a 向Chl b 的轉化（圖3）。綜上所述，不同的環境因子對植物葉綠素合成的調控位點可能不同。

低溫脅迫是早春作物幼苗階段經常面臨的環境脅迫，常常導致作物減產，而植物的轉綠過程對環境變化尤為敏感。通過對玉米轉綠過程中葉綠素合成前體物質的分析，本研究發現低溫通過影響ALA 向PBG 的轉化和Mg-Proto Ⅸ向Mpe 的轉化，降低 PBG、Urogen Ⅲ、Coprogen Ⅲ、Proto Ⅸ、Mpe、Pchlide、Childe 的積累量，進而降低Chl a 和Chl b產量；另外低溫還會抑制Chl a 向Chl b 的轉化，但更深入的調控機制還需進一步探究。