精血補片HPLC指紋圖譜建立同時測定主要成分含量*

寧良琦，鄭艷萍，蔡寶昌，童黃錦

1 安徽亳州市食品藥品檢驗中心，亳州 236803；2 南京海昌中藥集團有限公司，南京 210061；3 南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，南京 210028；4 江蘇省中醫藥研究院，南京 210028

精血補片，別名益腦片，由生曬參、紅參、制何首烏、紫河車、五味子、陳皮等6 味中藥配伍組成的非處方中成藥，具有補肝腎、益血氣、養心神的療效，用于神經衰弱、精神萎靡、頭暈目弦、心悸失眠等癥[1]。該品在部頒標準《中藥成方制劑》第六冊（WS3-B-1268-92）中只規定了性狀、顯微鑒別、檢查3 項內容，并未涉及有效成分含量測定等重要檢驗項目。查閱相關文獻發現，僅有2 篇報道精血補片質量控制方面的研究[2，3]，涉及了薄層色譜法（TLC）對復方制劑中各味中藥進行定性鑒別和二苯乙烯苷含量測定的方法，不能全面反映精血補片復方制劑多成分共同作用的特征。故制定有效的質量標準是中藥安全有效的必由之路，可以反映中藥及其制劑中所含化學成分的種類及數量。

本文采用HPLC 法對精血補片進行系統研究，建立其指紋圖譜及橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素等4 種成分含量測定方法，為其全面質量評價提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

LC-20AD 高效液相色譜儀；BP121S 電子分析天平（Sartorius）。

橙皮苷對照品（批號161231），二苯乙烯苷對照品（批號160315），五味子醇甲對照品（批號161016），大黃素對照品（批號130526）均購于南京森貝伽生物科技有限公司；精血補片（批號150902、150601、150901、160401、160301、150903、151101、130301、120303、120301，江蘇海昇藥業有限公司）；乙腈為色譜純；甲醇等試劑為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脫（程序為0～10 min，5%～10%B；10～50 min，10%～25%B；50～65min，25%～45%B；65～80min，45%～45%B；80～115 min，45%～80%B）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解、定容，制得濃度分別為7.879、2.930、0.624、0.194mg·mL-1對照品溶液（Ⅰ）；分別精密量取以上對照品溶液各1 mL，加至5 mL 量瓶中，混勻后用甲醇定容，配制成含橙皮苷1.576mg·mL-1、二苯乙烯苷0.586mg·mL-1、五味子醇甲0.125 mg·mL-1、大黃素0.039 mg·mL-1的混合對照品溶液（Ⅱ），過微孔濾膜，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精血補片粉碎過65 目篩，稱取粉末樣品0.25 g，置50 mL 具塞錐形瓶中，加入石油醚（60 ℃～90 ℃）20 mL，超聲30 min，過濾，棄去濾液，將固體物蒸干，置于具塞錐形瓶中，量取甲醇20 mL，超聲30 min，過濾，濾液置水浴鍋上70 ℃蒸干，固體物加甲醇溶解，洗滌定容于2 mL 的量瓶中，搖勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精血補片指紋圖譜及含量測定方法建立對10 批樣品按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，其混合對照品HPLC 色譜圖見圖1-A，樣品HPLC 圖譜見圖1-B。根據10 批不同批次樣品的液相指紋圖譜分析及數據計算，結果對比得出共有峰15 個，10 批次指紋圖譜比較見圖1-C。

圖1 HPLC 色譜圖譜

2.4.2 線性關系考察 取“2.2”項下的混合對照品溶液（Ⅱ）50、100、200、500、1 000 μL 置1 mL 量瓶中，用甲醇定容，制成不同濃度的混合標準品，將稀釋的混合標準品，按“2.1”項色譜條件檢測，以進樣量X 為橫坐標，以峰面積Y 為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及對照品溶液線性范圍等，見表1。

表1 標準曲線

2.4.3 進樣精密度試驗 取樣品（批號160301）按“2.3”項配制供試品溶液，連續進樣6 次，每次進樣量10μL，按“2.1”色譜條件檢測，測定其HPLC 色譜圖，以橙皮苷為參考峰，對色譜圖中15 個共有指紋峰進行考察，結果表明，共有指紋峰的保留時間RSD 均＜0.4%，共有峰峰面積RSD 均＜1.8%，說明儀器精密度較好。

2.4.4 穩定性試驗 取樣品（批號160301）按“2.3”項配制供試品溶液，分別于0、4、8、16、24 h 重復進樣，每次進樣量10 μL，按“2.1”項色譜條件檢測，測定其HPLC 色譜圖，以橙皮苷為參考峰，對色譜圖中的15 個共有指紋峰進行考察，結果表明，共有指紋峰的保留時間RSD 均＜0.8%，共有峰峰面積RSD均＜1.7%，說明供試品溶液在24 h 內穩定性較好。

2.4.5 重復性試驗 取樣品（批號160301），按“2.3”項制備供試品溶液共6 份，按“2.1”項色譜條件檢測，測定其HPLC 色譜圖，以橙皮苷為參考峰，對色譜圖中的15 個共有指紋峰進行考察，結果表明，共有指紋峰的保留時間RSD 均＜0.7%，共有峰峰面積RSD 均＜2.5%，說明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取樣品（批號160301）粉末，精密稱取0.125 g 9 份，置于50 mL 具塞錐形瓶中，按“2.3”項制備供試品溶液，在最后固體物中依次加入混合對照品溶液0.57、0.57、0.57、0.71、0.71、0.71、0.86、0.86、0.86 mL 后，再用甲醇定容至2 mL，按“2.1”項色譜條件檢測，測定其HPLC 色譜圖，分別記錄4 種成分的峰面積，根據“2.4.2”的標準曲線計算橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素的含量和加樣回收率，其平均回收率分別為100.01%（RSD 1.27%）、100.49%（RSD 1.53%）、100.32%（RSD 1.41%）、99.67%（RSD 1.42%）。

2.4.7 含量測定 取10 批樣品，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件檢測4 種成分的含量，結果見表2。

表2 樣品4 種成分含量測定結果（mg·g-1，n=3）

2.4.8 精血補片指紋圖譜相似度分析 取10 批樣品制成供試品溶液，分別精密量取10 μL，依次注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將10 批樣品的實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A 版”軟件，以中位數法對樣品的指紋圖譜進行峰點校正，數據匹配分析，生成共有模式圖，10 批樣品溶液匹配色譜見圖1-C，相似度評價結果見表3。

表3 10 批精血補片供試品溶液相似度評價結果

3 討論

樣品處理：比較了水浴加熱回流和超聲兩種方式，結果顯示超聲分離效果較好；80%甲醇和100%甲醇超聲處理，區別不大；而采用石油醚進行脫脂，可去除一些小極性的化學成分。

對供試品溶液進行全波長掃描：分別以234 nm、284 nm 作為檢測波長時，色譜圖或基線漂移較明顯或色譜峰數較少；以254 nm 作為檢測波長時，色譜峰數目較多且分離度較好，基線平穩，峰形對稱。

對流動相選擇時發現：甲醇-水洗脫出的峰分離度不好，且峰形欠佳；乙腈-水洗脫出的峰數目較多、分離度較高，個別峰形不佳，可在水相中加入少量甲酸改變峰形，故選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動相。

中藥指紋圖譜技術采用宏觀分析方法，能基本反映中藥的化學成分及其含量分布狀況，可以用來作為鑒別中藥真偽優劣的依據。本實驗在建立精血補片的HPLC 指紋圖譜的基礎上，實現了通過相似度分析對不同批次精血補片質量進行評價，可解決本品以單一化學成分作為質量評價標準的局限性問題，也為精血補片的質量控制提供了新的參考。