蟾毒靈通過下調PKM2抑制黑色素瘤細胞增殖、遷移與侵襲的實驗研究

石 婷，張 雯，周 群，朱余兵

南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）藥學部，南京 210006

腫瘤細胞的“瓦伯格效應”與糖酵解途徑中關鍵酶的異常表達密切相關，近年來研究發現，M2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）在腫瘤糖酵解及腫瘤轉移過程中發揮著至關重要的作用[7-9]。同時也有研究報道，黑色素瘤具有高度活躍的糖酵解進程，且PKM2 呈過表達狀態，提示PKM2 可能是抑制黑色素瘤侵襲與轉移并能有效治療黑色素瘤的潛在靶點[10]。

蟾毒靈（bufalin）作為一種甾體類化合物，是中藥蟾酥中的主要活性成分，也是蟾酥發揮抗腫瘤的主要活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、強心、調節免疫等生理活性[11，12]。越來越多的研究顯示，蟾毒靈對多種腫瘤細胞具有顯著的增殖抑制作用[13]，然而關于蟾毒靈對黑色素瘤增殖、侵襲及其相關機制的研究尚未有明確報道。因此，本研究旨在考察蟾毒靈對黑色素瘤細胞增殖、遷移與侵襲，以及對黑色素瘤細胞糖酵解過程的影響，并對其相關作用機理進行探討。

1 材 料

1.1 材料與藥品、試劑

人源A375 黑色素瘤細胞（中國科學院上海生命科學研究院）。

蟾毒靈（純度＞95%，上海安耐吉化學有限公司）；乳酸測試盒（南京建成生物工程研究所）；丙酮酸激酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司）；絲氨酸（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

Western blot 所涉及抗體：GAPDH（Bioworld 公司）；PKM2（SAB 公司）；MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin（CST 公司）。

Transwell 小室（美國Corning 公司）。

1.2 儀器與設備

二氧化碳培養箱（型號311，Thermo Fisher Scientific）；酶標儀（型號Synergy2，美國Bio Tek）；凝膠成像系統（型號GelDoc 2000，美國Bio-Rad）。

2 實驗方法

2.1 蟾毒靈對A375 細胞增殖的影響

A375 細胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養基、在培養條件為37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養。取對數生長期的細胞，用胰酶消化后離心，重懸細胞后計數，調整細胞濃度為4×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔200 μL 細胞懸液，培養過夜，待細胞增長至約75%左右時，分別加入不同濃度的蟾 毒靈（1、2、4、8、16、32、64、128 nmol·L-1）以 及 對照溶劑，孵育24 h 后吸棄上清液，每孔加入MTT 100μL 繼續培養4h 后吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO 振蕩10 min，在490nm 波長下測定吸光度值（A）。

圖4所示為氯氣物質的量分數為0.02%的氮氣體系中氯氣的吸附穿透曲線（吸附壓力為0.3 MPa，氮氣流量為25 mL/min，室溫）。分析可知，兩種活性炭基脫氯劑均具備微量氯深度凈化性能，均能將氯含量脫除至物質的量分數小于0.00002%。但相比而言，CT-01I具備更優的微量氯深度凈化性能，其氯穿透時間為61.3 min，遠優于AC-101的44.6 min。

細胞增殖活力（%）=（1－A實驗組/A溶劑對照組）×100%。重復3 次。

2.2 蟾毒靈對A375 細胞乳酸分泌和葡萄糖消耗的影響

將A375 細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細胞濃度為7.5×104個/mL，待細胞貼壁生長至約70%后，吸棄上清液，PBS 蕩洗一次，加入含不同濃度的蟾毒靈，并設定溶劑對照組，繼續培養24 h 后收集培養上清液，同時用胰酶消化細胞，計數每孔細胞數，根據檢測試劑盒的操作說明測定乳酸、葡萄糖含量，以每105個細胞分泌的乳酸、消耗的葡萄糖作為結果分析。

2.3 蟾毒靈對A375 細胞丙酮酸激酶活力的影響

將A375 細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細胞濃度為7.5×104個/mL，待細胞貼壁生長至約70%后，吸棄上清液液，PBS 蕩洗一次，加入含不同濃度的蟾毒靈，并設定溶劑對照組，繼續培養24 h 后胰酶消化細胞，用細胞裂解液裂解細胞，離心后取上清液，測定上清液蛋白含量，依據試劑盒操作說明檢測蛋白上清液中丙酮酸激酶的活力。

2.4 蟾毒靈對A375 細胞遷移與侵襲的影響

劃痕實驗：將A375 細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細胞濃度為2×105個/mL，待細胞貼壁生長至80%～90%，吸棄上清液，PBS 蕩洗一次，用10 μL 槍頭沿孔的中線垂直劃痕，PBS 蕩洗兩次后，加入含不同藥物的無血清培養基，分別設4 個組：溶劑對照組、絲氨酸組（Serine，1 mmol·L-1）、蟾毒靈組（8 nmol·L-1）、絲氨酸（1 mmol·L-1）+蟾毒靈（8 nmol·L-1）組。于0 h、24 h 分別在倒置顯微鏡下拍照。

Transwell 侵襲實驗：待細胞處于對數生長期，提前一天用無血清培養基培養過夜，次日胰酶消化后重懸細胞。在transwell 小室（24 孔板）內鋪上50 μL的基質膠，在24 孔板中加入含15%的胎牛血清培養基，上室中加入含不同藥物的用無血清培養基重懸的細胞懸液100 μL（1×106個/mL），分別設4 個組：分組同“2.4”該節劃痕試驗。在培養箱中繼續培養24 h 后取出小室，PBS 蕩洗后用棉簽擦去小室內多余的細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，晾干，利用0.5%結晶紫染色15 min，PBS 蕩洗3 次，于倒置顯微鏡下拍照，計算穿膜后在膜底部貼壁的細胞數量。

2.5 免疫印跡實驗檢測蟾毒靈對PKM2 及腫瘤轉移相關蛋白的影響

將A375 細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細胞濃度為2×105個/mL，待細胞貼壁生長至約70%后，吸棄上清液，PBS 蕩洗一次，加入含不同濃度的蟾毒靈，并設定溶劑對照組，繼續培養24 h，以胰酶消化細胞，用細胞裂解液裂解細胞，離心后取上清液，檢測上清液蛋白含量，確定蛋白上樣量。通過SDS-PAGE凝膠電泳后，將凝膠中的蛋白通過濕轉至PVDF 膜上。利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗膜5次，每次10 min。然后加入對應的一抗孵育，4 ℃過夜，回收一抗，用TBST 洗膜5 次，每次10 min。室溫孵育二抗2 h，TBST 洗膜5 次，每次10 min。使用ECL 發光液顯色，凝膠成像系統成像。

2.6 統計分析

3 結果

3.1 蟾毒靈對黑色素瘤A375 細胞增殖的影響

為了確定蟾毒靈對黑色素瘤細胞A375 增殖的影響，利用MTT 實驗考察了蟾毒靈干預細胞后對細胞增殖能力的影響。結果顯示，蟾毒靈能夠有效抑制A375 細胞的增殖活力，當干預時間為24 h，蟾毒靈在濃度為16 nmol·L-1時就能顯著抑制A375 細胞的增殖，并呈劑量依賴性和時間依賴性。見圖1。為了排除細胞增殖對蟾毒靈干預細胞的影響，后續實驗采用的蟾毒靈濃度為1、2、4、8 nmol·L-1。

3.2 蟾毒靈對A375 細胞乳酸生成、糖耗量及丙酮酸激酶的影響

圖1 蟾毒靈對A375 細胞增殖的影響（n=3）

多數腫瘤細胞即使在氧氣條件充足的情況下，仍然選擇有氧糖酵解作為主要功能方式，其主要特征是葡萄糖消耗增加以及乳酸生成增多[5，6]。為了考察蟾毒靈是否對A375 細胞有氧糖酵解有抑制作用，首先考察了蟾毒靈對A375 黑色素瘤細胞乳酸生成及糖耗量的影響。如圖2-A 和圖2-B 所示，蟾毒靈能夠劑量依賴性的抑制A375 細胞的乳酸生成量和葡萄糖消耗量。其次，繼續考察了蟾毒靈對糖酵解中關鍵激酶—丙酮酸激酶的影響。如圖2-C 所示，蟾毒靈干預A375 細胞后，顯著抑制了A375 細胞內丙酮酸激酶的活力，表明蟾毒靈可能通過抑制丙酮酸激酶，進而下調了A375 細胞內的糖酵解水平，抑制A375 細胞的增殖。

3.3 蟾毒靈對A375 細胞遷移與侵襲的影響

圖2 蟾毒靈對A375 細胞糖酵解和丙酮酸激酶的影響

有研究顯示，腫瘤細胞的糖酵解進程與腫瘤遷移、侵襲密切相關，過度活化的糖酵解進程能夠促進腫瘤細胞的遷移與侵襲[6]。因此進一步考察了蟾毒靈對A375 細胞遷移與侵襲的影響，并利用PKM2的激動劑干預，探討了PKM2 在蟾毒靈對A375 細胞遷移與侵襲過程的作用。如圖3-A 所示，在劃痕實驗中，蟾毒靈干預A375 細胞后顯著抑制了A375細胞的水平遷移能力；而PKM2 激動劑絲氨酸促進了A375 的遷移，當蟾毒靈與絲氨酸共同干預后，絲氨酸的促遷移作用被顯著逆轉。在transwell 小室實驗中也得到了相一致的結果（見圖3-B）。這些結果表明，蟾毒靈抑制A375 細胞的遷移與侵襲能力與下調PKM2 相關。

圖3 蟾毒靈對A375 細胞遷移與侵襲的影響（n=6）

3.4 蟾毒靈對A375 細胞中PKM2 及腫瘤轉移相關蛋白表達的影響

有報道關于，PKM2 的過表達能夠促進腫瘤細胞的增殖與侵襲，并且能夠調控腫瘤侵襲相關蛋白的表達[8，9]。為了進一步明確蟾毒靈對A375 細胞增殖與侵襲的抑制作用與PKM2 的相關性，考察了蟾毒靈對PKM2 及腫瘤轉移相關蛋白表達的影響。Western blot 結果顯示，蟾毒靈能抑制A375 細胞中PKM2 的蛋白表達（見圖4-A）；并且能下調促進腫瘤侵襲相關蛋白MMP2、MMP9 和N-cadherin 的表達，上調抑制腫瘤侵襲相關蛋白E-cadherin 的表達（見圖4-B）。以上結果提示，蟾毒靈對A375 細胞增殖、侵襲的抑制作用與其下調細胞內糖酵解進程和PKM2 的表達相關。

圖4 蟾毒靈對A375 細胞中PKM2 及相關蛋白表達的影響（n=3）

4 討論

現代研究表明，腫瘤細胞的有氧糖酵解促進了腫瘤的增殖與侵襲，其中糖酵解過程中的關鍵限速酶-PKM2 的高表達，是腫瘤細胞有氧糖酵解高度活躍的關鍵調控蛋白之一[14]。近年來，越來越多的研究發現，PKM2 的高表達促進了腫瘤的增殖與侵襲[15，16]，提示過度表達的PKM2 有可能通過加速腫瘤細胞的有氧糖酵解，進而促進了腫瘤細胞的增殖與侵襲。

本實驗結果表明蟾毒靈能顯著抑制A375 黑色素瘤細胞的增殖能力；而在對細胞增殖沒有顯著影響的劑量下，蟾毒靈能抑制A375 細胞的有氧糖酵解及丙酮酸激酶的活力，并能顯著抑制A375 的遷移與侵襲。進一步研究發現，在加入PKM2 激動劑絲氨酸[17]的條件下，蟾毒靈能逆轉絲氨酸對A375細胞遷移與侵襲的促進效應。有研究顯示，腫瘤細胞中的PKM2 能調控多種與腫瘤侵襲的相關蛋白，包括MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin[18]，其中MMP-2、MMP-9、N-cadherin 的過表達與E-cadherin 的低表達，能促進腫瘤的轉移與侵襲。在本研究中發現，蟾毒靈能劑量依賴性的抑制PKM2 的蛋白表達，同時對MMP-2、MMP-9、N-cadherin 也有顯著的抑制效應，對于E-cadherin 具有促進作用。

綜上所述，本研究表明，蟾毒靈可能通過抑制A375 黑色素瘤細胞有氧糖酵解過程中的關鍵酶PKM2，進而下調MMP-2、MMP-9、N-cadherin 的表達，并上調了E-cadherin 的表達，從而抑制了A375黑色素瘤細胞的增殖、遷移與侵襲。

本研究初步探討了蟾毒靈對A375 黑色素瘤細胞有氧糖酵解過程中的關鍵酶PKM2 的影響，提示通過抑制腫瘤細胞中PKM2 的表達可以成為抑制腫瘤細胞增殖與侵襲的一種途徑，為研發靶向PKM2 的抗腫瘤藥物提供了一個新的思路。