多次應用氟西汀對苯環己哌啶誘導的青年大鼠自主運動增多行為的長期影響*

束 慶，嚴思敏，姚 瑤，葛衛紅，李 鳴

1南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 藥學部，南京 210008；2 內布拉斯加州-林肯大學 心理系，美國 68588-0308

氟西汀（fluoxetine，FLX）是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI），臨床上用于抑郁癥、強迫癥及精神分裂癥伴有抑郁、強迫、欣快感缺失等癥狀的治療。2006年FLX 被批準用于8 歲以上兒童輕、中度抑郁癥的治療，該藥用于青少年患者的治療正日益增加[1]。但是，研究提示FLX 會增加兒童和青少年的自殺傾向和攻擊行為，SSRI 會對青少年的神經系統的發育產生影響[2]。本研究者前期的研究發現，大鼠在青少年時期暴露于抗精神分裂癥藥物奧氮平（olanzapine，OLZ）、氯氮平（clozapine，CLZ）[3]、利培酮（risperidone，RIS）[4]和阿塞那平（asenapine，ASE）[5]后，會影響大鼠成年后再次暴露于這些藥物時產生的反應行為。因此，本研究擬考察大鼠青年時期使用FLX 對大鼠成年后行為的長期影響。目前，關于青年時期暴露于FLX 的研究多集中于母性剝奪應激[6]或者是宮內缺氧等模型[7]，未見關于苯環己哌啶（phencyclidine，PCP）誘導的自主運動（locomotor activity，LA）增多的青年大鼠模型中的研究。此類研究的結果多涉及治療效果[8]或不良反應[9]，關于藥物引起動物行為改變的長期影響的研究卻甚少。

PCP 能使正常人產生擬精神病癥狀和加重精神分裂癥患者的某些精神癥狀。而對大鼠則會誘導產生LA 過多、認知和感覺的異常，以及社會交往的退縮行為等，這都模擬了臨床患者精神分裂癥的行為表現。抗精神分裂癥藥物如CLZ、OLZ、ASE 等可以有效地改善PCP 模型的行為表現[3，5]。此外，PCP還可誘導大鼠在一些學習和記憶測試中表現出感覺門控（sensory gating，SG）功能障礙[10]。SG 是大腦的加工和處理信息的一種正常功能和對感覺刺激反應的調節能力。研究提示，精神疾病患者SG 功能存在障礙，即過濾無關刺激、保護有用信息這一處理過程發生損傷[11]。前脈沖抑制（prepulse inhibition，PPI）測試是考察SG 通道功能的一種有效檢測方式。Graham 提出“過程保護”（protection-of-processing）理論來解釋PPI：即較強的驚跳刺激之前、給予一個較弱的驚跳刺激不僅啟動信息的處理過程，而且是SG 防止干擾信息進入的一種自我保護機制[12]。PCP 會導致SG 受損，而抗精神分裂癥藥物對SG 受損導致的PPI 下降有改善作用[13]。PPI 是精神疾病診斷和治療的生物標記物和內表型指標[14]。

本研究應用PCP 建立精神分裂癥大鼠模型，在大鼠青年時期（第42～46 天）連續5 天給予FLX（5.0 mg·kg-1或10.0 mg·kg-1）。一方面，通過檢測大鼠LA 行為來評價FLX 是否具有抗精神分裂癥藥物的活性；另一方面，待大鼠成年后再次給予大鼠FLX 處理（第76 天和91 天），通過檢測LA 指標觀察既往在青年時期接受過FLX 處理的大鼠在成年后再次接受FLX 時大鼠LA 行為是否與青年時期未接受過FLX 處理的大鼠在LA 行為上存在差異，由此觀察青年時期的FLX 的暴露是否對成年后大鼠產生了長久的影響。最后，在大鼠生長發育的不同時期（第47、66、77、94 天）對大鼠進行PPI 測試，考察FLX 對不同年齡段大鼠SG 功能的影響作用。

1 材 料

1.1 實驗動物

青年雄性Sprague-Dawley 大鼠（101～125 g，鼠齡第37 天，Charles River，Portage，MI，USA）。大鼠每兩只飼養在一個48.3 cm×26.7 cm×20.3 cm 的透明飼養籠中，實行12 h 循環光照（時間為早6:30 至晚6:30）。室溫22 ℃±1 ℃，相對濕度45%～60%，食物和水充足。實驗開始前大鼠在動物房喂養5 天以適應新的環境。所有實驗均在相同的時間段（07:00～17:00）、相同的地點和環境中進行。飼養條件及實驗操作都按照美國內布拉斯加州—林肯大學動物倫理委員會的規定執行。

1.2 藥品和試劑

PCP 和FLX 溶于0.9%生理鹽水（vehicle，VEH）中。PCP 由美國國家成癮藥物管理機構提供；FLX由美國國家精神健康藥物供應組（NIMH）提供。PCP經皮下注射給藥，FLX 為腹腔注射給藥。所有實驗動物都按1.0mL·kg-1分別給予相應藥物。FLX5（5.0 mg·kg-1）或FLX10（10.0 mg·kg-1）劑量選擇是參考既往的相關研究[15]。PCP 的劑量選定為3.2 mg·kg-1，是基于實驗室前期的研究結果[16]；選擇這個劑量的PCP不僅可以誘導大鼠增加自主運動而且避免僵直重復行為的產生[17]。

1.3 儀器

1.3.1 大鼠自主運動行為（LA）檢測儀器 在一個安靜的房間里放置16 個長48.3cm、寬26.7cm、高20.3cm的透明有機玻璃箱，每個箱子的大小與大鼠的飼養籠完全一致，每個測試箱沿離底部3.2 cm 高的縱向位置上裝有6 個紅外光感應柱，柱間相隔7.8 cm。測試箱與電腦相連，相關軟件（Aero apparatus sixbeam locomotor system v1.4，Toronto，Canada）可以記錄光柱被打斷的次數，從而以光柱被打斷次數來反映大鼠在測試箱內的LA 次數。該裝置及其原理在以往的研究中有描述[3，4]。24 只大鼠根據鼠尾部編號依次分別放入每個測試箱中，分2 批進行測試。

1.3.2 前脈沖抑制（PPI）檢測儀器 用于考察大鼠SG 功能的6 個PPI 測試箱均購自Kinder Scientific公司。每個測試箱長35.56cm、寬27.62cm、高49.53cm，由同一個電腦程序控制，每個箱中頂部裝有一個可產生70～120 dB（decible，dB）直徑為11 cm 的發音裝置，每個箱子均由隔音材料組成，6 個箱子聲音互不干擾。在箱子的底部是一個感受壓力器，用于測量大鼠在聲音刺激下產生的驚跳反射程度。在實驗中，大鼠被置于一個可調節高度的長方形透明的有機玻璃制成的小盒中，小盒長19 cm、寬9.8 cm、高14.6 cm，將該小盒與箱子底部的壓力感受器連接后進行測試。一個批次可以對6 只大鼠進行測試。該裝置及原理在既往的研究中有描述[14]。

2 方 法

2.1 分組及其干預方法

24 只青年大鼠（第42 天）編號后，以隨機數字法分成4 組：空白對照組（VEH+VEH）、PCP 造模組（VEH+PCP）、FLX 低劑量組（FLX 5.0 mg·kg-1+PCP）和FLX 高劑量組（FLX 10.0mg·kg-1+PCP），每組6 只。

實驗安排見圖1：在實驗的第1～2 天，青年大鼠（第40～41 天）適應環境和自主運動測試儀器（30min/天）。第3～7 天，每天大鼠根據分組先給予VEH 或FLX（5.0 mg·kg-1或10.0 mg·kg-1）處理，然后立刻放入自主運動檢測裝置中，30 min 后再根據分組分別給大鼠VEH 或PCP（3.2 mg·kg-1）處理，立刻再將大鼠放入LA 檢測裝置中繼續檢測60 min，每天共進行90 min 的測試。連續5 天（第42～46 天）進行以上的給藥處理和LA 測試，通過檢測LA 指標觀察FLX 是否具有抗精神分裂癥藥物的活性。待大鼠成年后分別于第75、90 天時4 組大鼠在無任何藥物處理情況下，放入LA 測試儀器中再次適應環境和測試儀器（30 min/天）。與青年時期分別間隔30 天和45 天（即第76 和91 天）時，成年后的4 組大鼠都再次暴露于FLX（5.0 mg·kg-1）和PCP（3.2 mg·kg-1）處理并進行90 min[給予PCP 前30 min（即給予FLX 后30 min）+給予PCP 后60 min]的LA 測試。通過檢測LA 指標，觀察既往在青年時期接受過FLX 處理的大鼠、在成年后再次接受FLX 治療時、大鼠LA 行為是否與青年時期未接受過FLX 處理的大鼠LA 行為存在差異。此外，分別在大鼠生長發育的不同時期（第47、66、77、94 天），所有大鼠在無藥物處理情況下進行共4 次的PPI 測試，來評價FLX 是否會對PCP 建立精神分裂癥的大鼠的SG 通道功能產生影響，也是觀察FLX 是否具有抗精神分裂癥藥物活性的指標。

圖1 實驗安排流程圖

2.2 數據統計與分析

所有數據皆選用IBM SPSS 軟件進行統計分析。數據統計與分析方法參考既往本作者發表的同樣實驗設計的、關于抗精神分裂癥藥物的研究[3-5]。實驗中大鼠運動次數以均數+標準差（）表示，5 天連續給藥測定的結果采用混合設計方差分析（mixdesign ANOVA），結合Post-hoc LSD 進行組間差異的統計學分析。FLX 再激發測試，用當天的結果以單因素方差分析（one-way ANOVA）結合Post-hoc LSD分析。PPI 測試的結果采用重復測量方差分析（repeat-measure ANOVAs），結合Post-hoc LSD 進行組間差異的統計學分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠青年期間（第42～46 天）給予5 天FLX或PCP 處理后的LA 測試

由圖2-A 顯示，4 組大鼠連續5 天在給予VEH或FLX 后的30 min 內的平均LA 次數。Two-way ANOVA 顯示，組間有統計學差異：F（3，20）=4.410，P=0.016；測試的天數也有統計學差異：F（4，80）=15.485，P＜0.05；測試的天數與組間交互作用無統計學意義：F（12，80）=1.385，P=0.191。Post-hoc LSD 檢驗顯示，空白模型組大鼠的平均LA 次數顯著高于其他3 個組（Ps＜0.05）。

由圖2-B 顯示，4 組大鼠連續5 天在給予VEH或PCP 后的60 min 的平均LA 次數。Two-way ANOVA 顯示，組間有統計學差異：F（3，20）=15.356，P＜0.05；測試的天數有統計學差異：F（4，80）=2.823，P=0.030；但測試的天數與組間交互作用無統計學差異：F（12，80）=1.026，P=0.434。Post-hoc LSD 檢驗顯示，空白模型組大鼠LA 次數顯著低于VEH+PCP組（P＜0.05），也顯著低于FLX5+PCP 組（P＜0.05），以及FLX10+PCP 組（P＜0.05）。但是，VEH+PCP 組大鼠LA 次 數與FLX 兩組比較無統計學差異（Ps ＞0.543）。結果表明，FLX 對于PCP 誘導的LA 沒有顯著抑制或增加作用。

圖2 青年大鼠連續5 天藥物處理后的LA 次數（n=6/組）

3.2 大鼠在撤藥狀態下的LA 測試

再適應當天（第75 天）測試結果，由圖3-A 顯示，在行為學儀器箱中再次熟悉實驗環境時測定LA次數（30 min/天），分析后發現組間因素無統計學差異：F（3，20）=2.013，P=0.144。類似的結果也出現在第二次測試中（第90 天），見圖3-B，組間效應無統計學差異：F（3，20）=0.228，P=0.876。結果表明，既往FLX 處理的大鼠并未出現對FLX 處理的記憶效應。

3.3 成年大鼠在第76 天再次暴露于FLX 和PCP處理后的LA 測試

圖3 撤藥狀態下再次適應LA 實驗裝置時大鼠的LA 次數（n=6/組）

在第76 天，給予低劑量的FLX（5.0 mg·kg-1）、測試進行30 min 后的結果如圖4-A 所示。單因素方差分析顯示，各組之間無統計學差異：F（3，20）=0.984，P=0.420。在給予PCP 后的60 min 測試結果如圖4-B 所示，單因素方差分析后發現各組之間的LA 次數有統計學差異：F（3，20）=11.305，P＜0.05。由Post-hoc LSD 檢驗顯示，VEH+VEH 組大鼠的LA次數顯著低于其他3 組（Ps＜0.05），但VEH+PCP 組與FLX 2 組大鼠在LA 次數上無統計學差異（Ps＞0.830）。結果表明，FLX 對于PCP 誘導的LA 行為沒有顯著的抑制或增加作用。

圖4 第76 天大鼠再次接受FLX 和PCP 處理后的LA 次數（n=6/組）

3.4 成年大鼠在第91 天再次暴露于FLX 和PCP處理后的LA 測試

在第91 天，給予FLX（5.0 mg·kg-1）后的30 min結果如圖5-A 所示，單因素方差分析顯示，各組之間無統計學差異：F（3，20）=0.090，P=0.964。而給予PCP 后60 min 的測試中如圖5-B 所示，組間有統計學差異：F（3，20）=5.709，P=0.005。由Post-hoc LSD檢驗顯示，空白對照組大鼠的LA 次數顯著低于模型組（P＜0.05），也顯著低于FLX 兩給藥組（P＜0.05）。但是模型組與兩組FLX 大鼠在LA 次數上相比無統計學差異（Ps＞0.558）。結果表明，FLX 對于PCP 誘導的LA 沒有抑制或增加作用。

圖5 第91 天大鼠再次暴露于FLX 和PCP 處理后的LA次數（n=6/組）

3.5 大鼠在4 個不同年齡時期進行的PPI 測試

由圖6 所示，所有大鼠撤藥時4 次的PPI 測試結果，組間均無統計學意義：PPI 第47 天，P=0.342；第66天，P=0.358；第77 天，P=0.857；第94 天，P=0.957。“組×聲音分貝”的統計分析也未發現顯著差異，4 次的P 值依次為：P=0.198、P=0.773、P=0.581、P=0.426。

圖6 大鼠在4 個不同年齡時期進行的PPI 測試（n=6/組）

4 討論

人體在青少年到成年這一期間，中樞神經系統的發育，特別是在前額皮層、紋狀體、海馬的多巴胺和5-羥色胺這兩個神經遞質系統突觸的連接、受體的密度，經歷了非常巨大的變化[1]。因此，青少年時期使用FLX 有可能使得神經系統在發育和成熟進程中受到影響，也會改變成年后對藥物的反應。本研究應用PCP 建立精神分裂癥大鼠模型，在大鼠青年時期連續5 天給予FLX（5.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1）處理后，通過檢測大鼠LA 行為變化，來評價FLX 是否具有抗精神分裂癥藥物的活性。待大鼠成年后（第76、91 天）再次給予大鼠FLX（5.0 mg·kg-1）處理，觀察青年時期FLX 的使用是否對成年后的LA 行為產生影響。此外，在大鼠生長發育的不同時期（第47、66、77、94 天）對大鼠進行PPI 測試，考察藥物對大鼠SG 功能的作用。研究結果顯示，FLX 5.0mg·kg-1或10.0 mg·kg-1在5 天的給藥后都沒有抑制或增強PCP 誘導的LA 增多的作用，青年時期給予大鼠FLX處理沒有對大鼠成年后再次接觸FLX 時的LA 行為產生影響，FLX 沒有對大鼠中樞的SG 通道功能產生影響。抗抑郁藥FLX 在由PCP 建立的大鼠LA行為增多模型中未顯示出抗精神分裂癥的藥理作用。

研究表明，急性給予大鼠抗抑郁藥物如氟西汀、西酞普蘭對PCP 誘導的運動增多無抑制效果，但反復給予大鼠抗抑郁藥FLX、西酞普蘭則會對PCP 誘導的運動增多有增強的趨勢[15]。本實驗中FLX 對PCP 的效應未顯示出增強效應，可能原因在于：本實驗給予FLX 的方式是腹腔注射而不是口服，PCP 給予的劑量是3.2 mg·kg-1而不是10.0 mg·kg-1；另外也可能是給藥范式所導致的，本實驗中是在給予FLX 后的30 min 即皮下注射PCP，而文獻中的PCP 是在口服給予FLX 后的90 min。此外，作者前期利用該動物模型使用與本研究同樣的實驗范式考察青年大鼠接受抗精神分裂癥藥物OLZ、RIS[4]對成年后大鼠LA 行為和PPI 的影響。研究結果顯示，青年大鼠分別接受5 天的OLZ、RIS 處理后，這些藥物有顯著抑制了PCP 誘導的LA 增多行為。待大鼠成年后，青少年時期接受過OLZ 處理的大鼠，在成年時期再次接受OLZ 處理時的LA 次數顯著低于未接受過OLZ 的兩組大鼠（VEH+VEH，VEH+PCP）。OLZ 增敏在誘導階段的5 天連續給藥后的40 天仍然存在，且這個效應是劑量依賴性的。RIS的結果與OLZ 的類似，這提示RIS 和OLZ 都有著類似的受體的阻斷作用[3，4]。但是，抗抑郁藥物FLX在連續5 天的給藥階段沒有表現出抑制LA 的藥理作用，說明FLX 在PCP 建立的大鼠模型中未顯示出抗精神分裂癥藥的藥理作用。

既往有關PCP 損傷大鼠SG 通道的研究多是在急性給予PCP 時進行的PPI 檢測[18]，而不同于本實驗中進行的測試皆是在慢性使用PCP 后（即長期給予PCP 后大鼠在撤藥狀態下進行的檢測，如撤藥一天后等條件下）。這可能是本實驗中并未檢測到大鼠的SG 通道受到藥物處理的異常改變的原因之一。此外，也有研究提出，慢性長期的給予PCP 引起的大腦神經化學效應的改變與其對行為的影響可能并不是同步出現的[19]。

有關FLX 對于SG 的作用，在本研究中并未觀察到FLX 對PPI 的影響。類似本研究的報道有：在大鼠第33～53 天給予FLX（3.0 或10.0 mg·kg-1），然后在60 天后測定PPI，結果表明，FLX 未顯著影響大鼠PPI 功能[20]。另一篇研究表明，在大鼠出生的第25～46 天給予青年大鼠FLX（12.0 mg·kg-1），未見PPI 受到FLX 治療的影響[21]。此外，有研究通過飲水（0 或120.0 mg·L-1）的方式給予8～12 周的小鼠每天FLX（0 或15 mg·kg-1），在給藥后7 天或28 天后均未見FLX 顯著影響小鼠的PPI 功能[22]。而在給懷孕小鼠使用FLX，觀察其子代小鼠也未見FLX 對子代小鼠的PPI 功能與未接受FLX 處理的子代小鼠的PPI 功能有統計學差異[6]。值得關注的是，有一篇在小鼠青年時期每天分別給予FLX（3.0、15.0、20.0 mg·kg-1）處理后，觀察到FLX 有效地改善了PolyIC 造模的感染神經發育缺陷模型小鼠子代的PPI 缺陷。但是對于正常小鼠的后代，在青年時期使用FLX，仍然未見有顯著影響[23]。因此，關于FLX 對SG 的作用還需要進一步在不同精神分裂癥動物模型及其神經發育的不同時期進行深入的考察。

基于當今社會越來越多的青少年患者在發育時期會接受抗抑郁癥藥物的治療，因此，本研究使用青年大鼠來考察此類藥物的長期影響的實驗范式對臨床開展此類研究具有參考意義。未來還需要關注青年時期使用抗抑郁藥物對成年后大腦發育或行為的影響，來更好地闡明抗抑郁藥物的長期作用，保障青少年合理、安全使用精神類藥物。