白藜蘆醇抑制膀胱癌細胞體外侵襲能力的研究

張 棟，楊小杰，雒啟東，付德來，李釗倫，張 鵬，種 鐵

(西安交通大學第二附屬醫院泌尿外科，陜西西安 710004)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是廣泛存在于葡萄、花生和多種藥用植物中的一種多酚類化合物，其具有抗炎、抗氧化、保護心血管及抗腫瘤等多種生物學作用[1-3]，但其在膀胱癌中的作用少有報道。我們前期研究發現Res可抑制膀胱癌5637和T24細胞增殖并誘導其凋亡，本研究通過觀察Res對膀胱癌T24細胞的遷移及侵襲能力的作用，探討Res對膀胱癌細胞遠處轉移能力的影響及其機制，為膀胱癌的治療提供新的思路與策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料膀胱癌T24細胞株購自上海中科院生物化學與細胞生物學研究所。主要試劑Res購自美國Sigma-Aldrich公司，基質膠(Matrigel)購自美國BD公司，RPMI 1640細胞培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，MMP-2與MMP-9抗體均購自美國Santa Cruz公司，ECL發光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 用含10%胎牛血清(體積分數)的RPMI 1640培養基在37.5 ℃、5% CO2(體積分數)的培養箱內培養，以1.25 g/L胰酶和0.2 g/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的混合液消化傳代。

1.2.2劃痕試驗 收集對數生長期T24細胞接種至6孔板，待其面積匯合至接種板的90%后，用尖端粗細相同的10 μL槍頭劃數條直線，洗去刮起漂浮的細胞，加入30 μmol/L Res或二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，于24、48 h后采集圖像，觀察細胞遷移情況。

1.2.3體外侵襲實驗 應用24孔、膜孔徑8 μm的Transwell小室檢測細胞的體外侵襲能力。將Matrigel與無血清RPMI-1640培養基按1∶5的比例稀釋后，每室50 μL鋪于Transwell小室上室底部，置于37 ℃培養箱待其凝固。30 μmol/L Res處理24 h后，將100 μL含有5×104個 T24細胞的懸液接種于Transwell上室，每種細胞復種3室，同時復種DMSO對照組；下室加1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基。于37.5 ℃、5%CO2的培養箱內培養24 h與48 h后取出小室，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)清洗，棉簽擦拭上室附著的細胞。將已經侵入下層并貼附于微孔濾膜的細胞用40 g/L多聚甲醛固定5 min，吉姆薩(Giemsa)染色8 min，PBS清洗3次。顯微鏡下觀察，每張微孔濾膜隨機選3個視野進行細胞計數。

1.2.4實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RTPCR) 檢測MMP-2與MMP-9的表達Trizol試劑提取細胞RNA后，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，擴增50個循環。通過標準曲線計算Ct值，以GAPDH為內參，計算2-ΔΔCt值。引物序列如下：MMP-2上游引物：5′-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3′，MMP-2下游引物：5′-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3′，MMP-9上游引物：5′-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3′，MMP-9下游引物：5′-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT-3′。

1.2.5蛋白印跡試驗(Western blot) T24細胞按每孔1×106個密度接種至6孔板。用30 μmol/L Res培養24 h與48 h后，冰PBS小心洗滌，蛋白提取液提取總蛋白。12.5% SDS-PAGE電泳分離，電轉法轉至偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用MMP-2、MMP-9抗體4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育0.5 h，蛋白條帶ECL試劑盒顯色發光。

2 結 果

2.1 Res可抑制膀胱癌T24細胞的遷移能力30 μmol/L Res處理膀胱癌T24細胞24 h與48 h后，檢測T24細胞遷移能力。結果發現，Res顯著抑制T24細胞體外遷移能力，Res組較對照組細胞遷移能力顯著降低(圖1)。

2.2 Res可抑制膀胱癌T24細胞體外侵襲能力在驗證了Res可抑制T24細胞體外遷移能力后，我們進而檢測了Res對T24細胞侵襲能力的影響。結果表明：30 μmol/L Res處理膀胱癌T24細胞24 h后，其侵襲能力受到顯著抑制(P<0.05，圖2)。

2.3 Res可抑制膀胱癌T24細胞MMP-2與MMP-9的表達Res處理T24細胞24 h與48 h后，應用Real-time PCR與Western blot檢測MMP-2與MMP-9的表達變化。結果提示，Res可從mRNA與蛋白水平顯著抑制T24細胞MMP-2與MMP-9的表達，且呈時間依賴性(P<0.05,圖3)。

圖1 劃痕試驗檢測Res及DSMO不同培養時間的遷移能力

圖2 Transwell小室檢測Res和DMSO在不同培養時間的侵襲能力

圖3 Real-time PCR及Western blot檢測Res作用下膀胱癌T24中MMP-2與MMP-9的表達

A：Res處理后Real-time PCR檢測MMP-2與MMP-9的表達量，*P<0.05；B：Res處理后Western blot檢測MMP-2與MMP-9的表達。

3 討 論

Res是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于蓼科植物虎杖的根莖與根，豆科植物花生的種子，葡萄科植物葡萄果實的皮與籽等[4-5]。Res最初在1924年被發現，但近年來才逐漸受到重視并廣泛加以研究。目前的研究表明Res具有抗炎、抗氧化、抑制動脈粥樣硬化和血栓形成以及抗腫瘤等多種生物學功能[1-3,6-8]，其中抗腫瘤作用最令人關注。Res對多種實體腫瘤如肝細胞癌、乳腺癌、結腸癌等具有顯著的抑制作用[9-11]，但對膀胱癌的作用目前知之甚少。我們前期研究發現，Res可抑制膀胱癌5637和T24細胞增殖并誘導細胞凋亡，并且可以提高膀胱癌細胞對TRAIL誘導的細胞凋亡作用[12]。本研究中我們檢測了Res對膀胱癌T24細胞遷移與侵襲能力的影響。Res處理T24細胞24 h與48 h后，膀胱癌細胞體外遷移能力顯著下降。我們進而應用Matrigel模仿細胞外基質測定Res對T24細胞侵襲能力的影響，發現Res處理T24細胞24 h與48 h后，對照組穿膜細胞數較Res處理組細胞穿膜數顯著增多(P<0.05)，提示Res可抑制T24細胞體外遷移與侵襲能力。

腫瘤微環境是近年來的研究熱點，是指由腫瘤局部的各種細胞、細胞外基質、酶和細胞因子等共同構成的微環境。其中細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是腫瘤的天然組織學屏障，ECM或基膜的降解是腫瘤侵襲與遠處轉移的關鍵環節[13-14]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一個大家族，主要功能是降解ECM，在胚胎發育、血管生成、纖維化疾病及惡性腫瘤的浸潤與遠處轉移等病理生理過程中發揮著重要的作用。其中Ⅳ型膠原酶為研究最多的一類，它主要有兩種形式：一種被糖化，分子量為92 ku，命名為MMP-9；另一種非糖化，分子量為72 ku，被稱為MMP-2。當前對MMP-2，MMP-9的研究較深入，MMP-2和MMP-9又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶，可以通過降解基膜主要成分Ⅳ型膠原，促進多種惡性腫瘤的侵襲和轉移[15-16]。最近的研究顯示：Res能明顯抑制肺癌、乳腺癌細胞及膠質瘤細胞MMP-2和MMP-9表達[17-19]。本研究結果顯示Res處理膀胱癌細胞后，細胞侵襲能力顯著下降，且細胞中MMP-2和MMP-9表達水平明顯降低，提示Res可能通過抑制MMP-2和MMP-9的表達從而抑制膀胱癌細胞的侵襲能力。

綜上，我們的結果證實Res可能通過下調膀胱癌T24細胞中的MMP-2與MMP-9的表達而抑制其體外遷移與侵襲能力，Res可能成為臨床膀胱癌治療的新策略。