膀胱癌中自噬相關基因Beclin1和Bcl2 mRNA表達相關性及其臨床意義

王振龍，湯 輝，李洪亮，薛玉泉，薛 力，鐘 鐵

(西安交通大學第二附屬醫院泌尿外科，陜西西安 710004)

膀胱癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤，多表現為間歇性、無痛性血尿。在全球范圍內，膀胱癌的發病率居惡性腫瘤第11位，在西方國家泌尿系統惡性腫瘤中的發病率僅次于前列腺癌，位居第2[1]，但在我國是發病率最高的泌尿系統惡性腫瘤，根據《2012中國腫瘤登記年報》統計，我國膀胱癌發病率約為6.6/10萬人，在所有惡性腫瘤發病率中排第9位，發病年齡在51～70歲最常見，其中男性發病率約為女性的3～4倍[2]。根據膀胱癌浸潤深度及轉移情況，可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌，非肌層浸潤性膀胱癌包括Tis、Ta、T1，肌層浸潤性膀胱癌為T2以上。影響膀胱癌進展的因素有腫瘤分期、分級、腫瘤大小和數量[3]。肌層浸潤性膀胱癌患者的預后很差，與腫瘤浸潤深度和淋巴結情況有關，5年總體生存率為25%～66%[4-5]。外科手術聯合術后膀胱灌注化療是常用的治療手段，但是1995至2015年期間，膀胱癌病死率并沒有得到顯著控制[6-7]。

膀胱癌是由多基因、多步驟調控異常所導致的惡性腫瘤。因此探究闡明膀胱癌發生發展的生物學機制，可為找到針對性治療膀胱癌提供理論依據。自噬基因Beclin1和B淋巴細胞瘤2基因(B-cell lymphoma2，Bcl2)與腫瘤的發生發展密切相關[8]，但在膀胱癌發病中的機制和關系研究僅停留在蛋白水平，且聯合檢測這兩個基因的表達與膀胱癌相關性的報道很少。因此，本研究擬采用分支-DNA液相芯片法測定膀胱癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織中Beclin1和Bcl2 mRNA水平，并分析Beclin1和Bcl2 mRNA表達水平與膀胱癌臨床病理特征的關系，為膀胱癌的臨床診斷、治療方案的選擇及療效預測提供依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集2015年1月至2017年12月在西安交通大學第二附屬醫院泌尿外科就診的膀胱癌患者組織標本53例，均經影像學檢查、實驗室檢查及手術后病理證實。男性32例，女性21例；年齡38～81歲，中位年齡61歲。所有病例手術前均未接受放、化療，為初治病例。同期取距離腫瘤組織3 cm處癌旁組織20例作為正常組織對照組。

1.2 樣本制備腫瘤組織及癌旁正常組織用生理鹽水清洗干凈，再用10%的福爾馬林溶液(體積分數)固定16～24 h，用乙醇洗滌后，送至廣州益善醫學檢驗所(中國廣州，廣州科學城)進行檢測。

1.3 Beclin1和Bcl2 mRNA的表達檢測采用分支DNA-液相芯片法，同時檢測樣本中的Beclin1和Bcl2 mRNA表達。樣本裂解后經由微球捕獲，利用擴增探針特異雜交對信號放大，通過液相芯片儀讀數判斷結果，該方法能在一次反應中對多基因mRNA的表達同時測定，具體操作如下：①將裂解液加入一定的待測樣品中，55～58 ℃環境下裂解120 min；②裂解后將其轉移到孵育板，加入探針-微球、延伸探針及緩沖液于55 ℃環境中震蕩孵育過夜；③第2 d把孵育板轉移到磁力架上靜置1 min，促使磁性微球沉積至底部，吸取上清液并棄之；④去除上清液后將洗滌液加入其中，震蕩洗滌1 min，隨后再把孵育板轉移到磁力架上靜置1 min，棄去上清液，反復3次；⑤雜交，加入延伸探針、標記探針，在50 ℃下震蕩反應60 min；⑥再次洗滌，將孵育板放在磁力架上靜置1 min，棄去上清液，洗滌2次；⑦接著加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，于50 ℃環境下震蕩反應30 min，然后將孵育板放置在磁力架上1 min，棄去上清，洗滌2次；⑧讀數，加入洗滌液后震蕩5 min，通過Luminex閱讀儀(Luminex公司，美國得克薩斯州)讀取數據，并分析獲得的檢測結果。

1.4 結果判定Beclin1、Bcl2 mRNA表達水平以高、中、低表示，表達水平大于或等于75%為高表達，65%～75%為中偏高表達，40%～65%為中表達，40%～25%為中偏低表達，小于25%為低表達。將高表達、中偏高表達記為高表達[Beclin1(+)、Bcl2(+)]；中表達、中偏低表達和低表達記為中低表達[Beclin1(-)、Bcl2(-)]，如圖1所示。

圖1 mRNA表達分布劃分圖

1.5 統計學分析采用SPSS 18.0軟件，計數資料的比較采用χ2檢驗，配對資料的關聯性分析采用Person或Spearman相關系數來描述，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中Beclin1、Bcl2 mRNA的表達膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA的高表達率分別為45.3%和26.4%，均顯著低于癌旁正常組織的90.0%和55.0%，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 膀胱癌組織和癌旁組織中Beclin1、Bcl2 mRNA的表達 [例(%)]

2.2 Beclin1、Bcl2 mRNA表達與膀胱癌臨床病理的關系在膀胱癌組織中，Beclin1 mRNA的高表達率在不同病理分級、臨床分期、生長方式以及淋巴結轉移狀態之間差異有統計學意義(P<0.05)；Bcl2 mRNA高表達率在不同病理分級、臨床分期以及淋巴結轉移狀態之間差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 不同病理分級、臨床分期、生長方式以及淋巴結轉移狀態膀胱癌組織中Beclin1、Bcl2 mRNA的表達 [例(%)]

2.3 膀胱癌中Beclin1和Bcl2 mRNA表達的相關性分析對53例膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA的高表達率和中低表達率進行Spearman相關分析，結果顯示，膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA兩者的高表達率之間呈負相關(r=-0.287,P=0.037)。

3 討 論

目前認為，腫瘤的發生發展與細胞增殖失控和細胞死亡抑制密切相關。細胞的3種程序性死亡方式分別為細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬。細胞凋亡又稱Ⅰ型程序性死亡，是一種不同于壞死及自噬性死亡的細胞生理性死亡方式，它是受一系列基因調控的有序性死亡[9]。Bcl2基因是細胞凋亡抑制基因，在抑制細胞凋亡過程中發揮重要作用。Bcl2基因編碼的蛋白質可以抑制細胞凋亡途徑，延長細胞生存并增加細胞分裂，導致細胞過度異常聚集，促進腫瘤的發生發展。在前列腺癌和乳腺癌組織中，Bcl2的表達顯著升高[10]。但是在膀胱癌發生發展中的作用未見相關報道。本研究中，凋亡抑制基因Bcl2 mRNA在膀胱癌組織中的高表達率低于癌旁正常組織，且隨著病理分級和臨床分期的升高，高表達率也逐漸升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示在膀胱癌發生發展中，凋亡抑制基因Bcl2發揮了重要作用。

細胞自噬也稱為Ⅱ型程序性死亡，是細胞利用溶酶體降解體內多余的蛋白質和亞細胞成分的催化過程[11]。研究表明，細胞自噬的發生與惡性腫瘤的發生、發展密切相關[12]。自噬基因Beclin1是參與哺乳動物自噬調控的特異性基因，具有調節細胞存活、分化和生長的作用，可以通過提高細胞自噬從而抑制腫瘤細胞的凋亡。在肺癌細胞A549中敲除Beclin1基因，會促進細胞生長，抑制細胞凋亡[13]。研究表明，Beclin1的表達在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌組織中分別下降了40%、50%、75%[14]。本次研究結果顯示，膀胱癌組織中Beclin1 mRNA的高表達率低于癌旁正常組織。提示在膀胱癌發生早期，細胞自噬可能被抑制，與段振玲等[15]在卵巢癌中的研究結論相似。Beclin1 mRNA的高表達率與膀胱癌病理分級、生長方式、TNM分期和淋巴結轉移等預后影響因素有關(P<0.05)，腫瘤分化程度越低，Beclin1 mRNA高表達率越低。在惡性程度更高的膀胱癌(T2～T4期)中，Beclin1 mRNA高表達率更低。李飛等[16]采用免疫組化方法研究Beclin1蛋白在膀胱癌組織中的表達，本研究結果與之一致，表明在膀胱癌發展惡化過程中，Beclin1基因表達發揮重要作用，證明Beclin1可作為膀胱癌診斷和治療新的生物標記物。

本研究采用分支DNA液相芯片技術檢測Beclin1和Bcl2 mRNA表達，與常用的mRNA表達檢測方法逆轉錄-聚合酶鏈反應技術(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)不同，分支DNA液相芯片法可直接對樣本裂解并進行檢測，不需要對樣本進行RNA抽提、純化、逆轉錄和目標片段擴增，減少了積累誤差，因此，最大程度保證檢測結果的可靠性。同時通過擴增探針進行信號放大，極大程度提高了檢測的靈敏度。

本研究還進一步分析了Beclin1和Bcl2 mRNA表達的相關性，發現膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA兩者的高表達率之間呈負相關(r=-0.287,P=0.037)。提示自噬和凋亡可能均參與了膀胱癌的發生發展，Bcl2表達對Beclin1相關的細胞自噬起負調節作用，其可能的機制是Beclin1的BH3區域可以和Bcl2結合，導致Beclin1調控的自噬作用減弱，細胞的凋亡抑制和增殖作用增強，該機制在卵巢癌細胞實驗中已被證實[17]。因此，可通過抑制Bcl2與Beclin1的BH3區域結合，從而進行膀胱癌的治療。

綜上所述，在腫瘤發生發展的不同階段，多種基因發揮著不同的作用，本實驗證實Beclin1和Bcl2 mRNA表達異常與膀胱癌的發生發展密切相關，聯合檢測Beclin1和Bcl2 mRNA表達對于膀胱癌的臨床分期、預后判斷具有重要作用。但是由于膀胱癌發生發展的復雜性，且本實驗并未深入研究Beclin1和Bcl2相互調控的分子機制，為精確了解膀胱癌的發生發展機制，尋找針對性的膀胱癌精準治療方案，需要更深層次地研究膀胱癌中Beclin1和Bcl2 mRNA相互作用的調控機制。