35株臨床分離的大腸埃希菌耐藥性與tem基因的鑒別

虞春華 高建華 潘斌輝 楊林 柯慧

摘 要 目的：對臨床分離的大腸埃希菌的耐藥性與編碼TEM型β-內酰胺酶基因（簡稱tem基因）的研究情況進行分析探討，為今后的臨床治療工作提供有價值的參考依據。 方法：選擇2017年6月—2018年6月間送檢的臨床標本作為研究對象，對其采用全自動微生物鑒定藥敏分析儀進行分離鑒定及藥敏分析，并對其中的35株耐藥大腸埃希菌展開tem 基因及 tem-1、tem-2 基因亞型檢測 。結果：藥敏試驗發現，35株大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥率為100.0%、對頭孢唑林的耐藥率為74.3%、對頭孢呋辛的耐藥率為 71.4%。經PCR擴增檢測發現，它們均為tem基因陽性。結論：目前臨床上分離的大腸埃希菌存在嚴重的耐藥性，tem基因攜帶率高，在今后的臨床用藥過程中，應對其給予足夠的重視。

關鍵詞 大腸埃希菌 耐藥性 tem基因

中圖分類號：R181.32 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）17-0047-03

Study on drug resistance and tem gene of 35 clinical isolates of Escherichia coli*

YU Chunhua1**， GAO Jianhua1， PAN Binhui2， YANG Lin1， KE Hui3（1. Department of Pathogens and Immunology， Jiangxi Medical College；2. Computer Teaching and Research Department of Jiangxi Medical College；3. Laboratory Department， the Peoples Hospital of Shangrao， Jiangxi Shangrao 334000， China）

ABSTRACT Objective： To analyze the drug resistance of clinical isolates of Escherichia coli and the genes coding for TEM type b-lactamase （tem gene）， and provide valuable reference for future clinical treatment. Methods： Clinical specimens obtained from June， 2017 to June， 2018 were selected as subjects. The analysis of isolates and drug sensitivity were performed by automatic microbial identification drug sensitivity analyzer and gene identification of 35 resistant E.coli strains were carried out by PCR amplification. Results： The drug sensitivity test showed that the ratio of resistance strains against ampicillin reached to100.0% in 35 strains of Escherichia coli detected， in which the resistance rate accounted for 74.3% to cefazolin， and 71.4% to cefuroxime. They all were tem gene positive by PCR amplification. Conclusion： The clinically isolated Escherichia coli has serious drug resistance and high tem gene-carrying rate at present， to which great attention should be paid in the future clinical medication.

KEy WORDS Escherichia coli； drug resistance； tem gene

大腸埃希菌是寄居在人和動物腸道中的菌群，生物學性狀與革蘭陰性菌相似，在遺傳學上與腸桿菌屬于親緣關系，在自然界是廣泛存在的，屬于條件致病菌[1]。若是機體免疫力低下或者是細菌侵入，會導致大腸埃希菌成為致病菌，誘發腸道外感染、消化道感染、呼吸道感染、泌尿系統感染、敗血癥等，范圍比較廣泛。大腸埃希菌為臨床常見的一種革蘭陰性菌，位居腸桿菌科細菌分離的第一位，會增加醫源感染發生率，對一些臨床常用的抗菌藥物呈現出明顯的多重耐藥性[2]。本次研究中，以對臨床分離的大腸埃希菌的耐藥性與tem基因的研究情況進行分析探討為目的，對我院收集到的送檢標本進行了細菌分離、鑒定以及tem基因檢測，并對檢測結果進行了統計分析，結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株來源于2017年6月至2018年6月間我院收集的送檢標本，包括中段尿、血液、痰、分泌物、膿液、胸腹水等。取標本接種于麥康凱及 SS 平板培養，革蘭染色鏡檢進行初篩，以全國臨床檢驗操作規程為依據，凡符合氧化酶陰性、發酵葡萄糖的菌株，接種腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管 （ GYZ-11e） 鑒定大腸埃希菌，保存于營養瓊脂斜面。選擇分離出的35株大腸埃希菌展開tem基因檢測，無重復菌株。

1.2 儀器與試劑

ABI 9700型PCR擴增儀（Techne公司）； 凝膠成像分析系統（上海領成生物科技有限公司）；Vitek2-Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀（法國BioMérieux公司）。

1.3 菌株鑒定與藥敏試驗

菌株經Del96Ⅱ全自動細菌鑒定儀鑒定和藥敏分析。

1.4 基因擴增

從GenBank尋找并下載tem-1、tem-2 和tem 基因序列，通過DNA序列比對找到其共有序列，并設計引物：P1：5-GAGTATTCAACATTTCCGTGTC-3，P2： 5-TAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3 ，擴增片段長度為535 bp。PCR擴增試劑購自中山大學達安基因股份有限公司，引物合成也委托其完成。

質粒的提取：參照UNIQ-10柱式小量抽提試劑盒提取細菌質粒DNA [3]。

PCR反應體系：10 ml DNA模板，25 ml 2×MasterMix， tem-1或tem-2上下游引物各2 ml，Taq DNA聚合酶（5 U/ml）0.5 ml，加ddH2O至50 ml。PCR擴增條件：95 ℃預變性 5 min，然后95℃ 1 min，65℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環35次，最后72 ℃ 延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳法分析擴增片段[4]，用凝膠成像儀采集圖像。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

藥敏試驗發現，大腸埃希菌對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松、左氧氟沙星、環丙沙星及復方新諾明均具有較高的耐藥性，對阿米卡星的耐藥率較低，對呋喃妥因、美羅培南及亞胺培南的耐藥率均為0（表1）。

2.2 耐藥基因檢測結果

35株大腸埃希菌TEM型b-內酰胺酶基因檢測全部呈現為陽性，部分菌株（S1～S6）PCR擴增片段的電泳圖見圖1。

3 討論

大腸埃希菌是院內感染監測中非常重要的病原菌之一，有資料顯示該菌株在醫院感染標本中分離率達到30～60%，其中產超廣譜b-內酰胺酶（ESBLs）的分離率更高，非常容易引起暴發流行，此外ESBLs易在菌株間傳播，導致耐藥菌產生和擴散從而影響治療效果[5-6]。

本研究結果發現，大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥率已經達到100%，對頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢曲松等一代、二代、三代頭孢菌素類存在明顯耐藥性，耐藥率均超過了65%，并且會對復方新諾明的耐藥率也達到了80%，提示這些藥物無法作為臨床治療大腸埃希菌誘發的感染性疾病[7]。此外，研究表示大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物具有顯著敏感性，提示碳青霉烯類藥物對大腸埃希菌、ESBLs大腸埃希菌均有較高的穩定性，與Han等[8]的報道結果基本一致。 病原菌基因型檢測也是提高用藥針對性和治療有效性的關鍵[9-10]，本研究應用TEM型b-內酰胺酶基因展開檢測，耐藥菌株tem基因均呈現為陽性，說明菌株對b-內酰胺類抗生素耐藥性多是tem基因編碼[11]。

綜上所述，本地區大腸埃希菌耐藥率非常高，尤其是對常見的廣譜抗生素耐藥率極高，本次實驗中所選取的藥物種類有限，細菌對其他藥物的耐藥機制尚需展開進一步的研究，旨在為大腸埃希菌的院內感染治療提供幫助。

參考文獻

[1] 李海英， 王炯， 白雅紅， 等. 連續5年臨床分離大腸埃希菌耐藥性的變遷[J]. 中華醫院感染學雜志， 2015， 25（3）： 511-513.

[2] 游樹林， 汪文明， 劉利航， 等. 327株產廣譜b-內酰胺酶大腸埃希菌的耐藥性分析[J]. 檢驗醫學與臨床， 2015， 12（11）： 2810-2812.

[3] 邢國勝， 孔瑞華， 馬忠慧，等. 臨床分離產超廣譜b-內酰胺酶大腸埃希菌耐藥基因分型研究[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2017（6）： 109-111； 114.

[4] 姚建平. TEM型b-內酰胺酶在耐多藥大腸埃希菌中的作用分析[D]. 四川瀘州： 西南醫科大學， 2016.

[5] 李君， 王倩青， 李力， 等. 婦科住院患者腹腔鏡手術切口感染大腸埃希菌耐藥性及耐藥基因檢測[J]. 中國病原微生物學雜志， 2015， 10（6）： 563-567.

[6] 李海英， 王金波， 白雅紅， 等. 產超廣譜b-內酰胺酶大腸埃希菌b-內酰胺酶基因研究[J]. 中華醫院感染學雜志， 2014， 24（19）： 4699-4701.

[7] 楊君洋， 盧洪洲. 大腸埃希菌腸道外感染及其治療的研究近況[J]. 上海醫藥， 2016， 37（7）： 21-24.

[8] Han JH， Nachamkin I， Tolomeo P， et al. Temporal changes in resistance mechanisms in colonizing Escherichia coli isolates with reduced susceptibility to fluorequinolones[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2013， 76（4）： 491-496.

[9] 茆海豐， 劉洪書， 趙勇， 等. 大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制研究[J]. 中華醫院感染學雜志， 2015， 25（15）： 3375-3377.

[10] Izdebski R， Baraniak A， Fiett J， et al. KPC-like carbapenemase-producing Enterobacterianceae colonizing patients in Europe and Israel[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2015， 60（3）： 1912-1917.

[11] Ballus J， Lopez-Delgado JC， Sabater-Riera J， et al. Surgical site infection in critically ill patients with secondary and tertiary peritonitis： epidemiology， microbiology and influence in outcomes [J/OL]. BMC Infect Dis， 2015， 15： 304. doi： 10.1186/s12879-015-1050-5.