let7a在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用及相關機制研究

彭微 劉求梅 劉潔 袁桂

412000湖南中醫藥高等專科學校基礎醫學部，湖南 長沙

肺癌在我國城市人口惡性腫瘤死亡原因排在第一位，發病率與死亡率呈逐年上升趨勢。肺癌可以分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類[1]。非小細胞肺癌可分為鱗癌、腺癌、大細胞癌，約占總體的80%。非小細胞肺癌與小細胞肺癌相比，癌細胞生長分裂比較慢，擴散轉移相對較晚，因而大多數非小細胞肺癌患者就診時已經是晚期，失去手術的機會。對于晚期不能手術的患者，首選采用鉑類藥物治療。盡管非小細胞肺癌的早期診斷和治療已經取得了一定的成就，但是目前5年生存率仍≤15%，即使早期發現，復發率仍舊很高[2]，并且在治療中細胞易對鉑類藥物產生耐藥性。本文就let7a在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用及相關機制報告如下。

資料與方法

A549 與A549/DDP 細胞均采用含10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL青霉素的雙抗1640培養基，放置于飽和適度85%、37℃、5%CO2條件下培養。其中A549/DDP 培養基中含有2 μg/mL 的順鉑以維持細胞耐藥性。所選取的實驗細胞均處于對數生長期。

方法：將A549 和A549/DDP 細胞分別接種于含5 mL 1640完全培養基的培養瓶中，待細胞生長到85%融合時，提取總RNA。A549 細胞在轉染前24 h 按1.5×105的細胞數接種到6 孔細培養板中，生長到80%左右轉染，并對處理前后A549 和A549/DDP 細胞let7a 表達水平進行PCR 驗證。分別用lipofectamine RNAimax對Let7a抑制物和陰性對照組進行轉染，采用細胞計數試劑盒(cck-8)，將細胞接種至試劑盒的96 孔板內，2 500～3 500/孔，細胞與壁貼合24 h 后每孔均 加入100 μL 含DDP 的1640 培 養基，A549 細胞系DDP 濃度為0.25、0.5、0.75、 1.0、 1.25、 1.5、 2.0 μ g/mL，A549/DDP 細胞系濃度梯度為2.4、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0 μg/mL。同時設置對照組為孔板只加入單細胞懸液。酶標檢測儀檢測450 nm 波長的吸收值，并計算細胞的ic50。取對數生長期的細胞制成單細胞懸液，并將其在孔板中進行稀釋，使細胞均勻分布。置于飽和適度85%、37℃、5% CO2條件下培養，待出現肉眼可見的克隆時，終止培養，進行計數克隆。流式細胞檢測：將A549 和A549/DDP 單細胞懸液分別接種在6 孔板中，轉染并且加藥維持培養，當細胞長滿時，消化成單細胞懸液，離心、漂洗后染色上機分析細胞凋亡率(凋亡率=早起凋亡率+晚期凋亡率)。實驗均重復3次，避免存在偶然性。

觀察指標：記錄分析細胞凋亡率、克隆集落數量、細胞增殖情況、細胞存活情況、ic50。

統計學方法：數據應用SPSS 18.0 軟件分析；計數資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；參數之間相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

通過分析比較細胞凋亡率：A549 轉染let7a 抑制物后，細胞凋亡率明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；A549/DDP轉染let7a抑制物后，細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

分析比較細胞ic50 值：A549 轉染let7a 后抑制物后細胞ic50 值增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；表示A549 對順鉑的敏感性下降，耐順鉑性增加；A549/DDP 轉染let7a 后細胞ic50 值降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；表示A549/DDP對順鉑的敏感性增加，順鉑耐藥性降低。見表2。

表1 A549與A549/DDP轉染后細胞凋亡率比較(±s，%)

表1 A549與A549/DDP轉染后細胞凋亡率比較(±s，%)

組別 凋亡率轉染前 轉染后A549 11.4±0.8 3.5±0.6 A549/DDP 12.1±1.1 14.2±1.3對照組 12.3±1.4 11.2±0.9 P＜0.05 ＜0.05

表2 A549與A549/DDP轉染前后細胞的ic50對比(±s)

表2 A549與A549/DDP轉染前后細胞的ic50對比(±s)

組別 Ic50(μg/mL)轉染前 轉染后A549 0.42±0.02 0.67±0.01 A549/DDP 5.71±1.30 4.43±1.21 P＜0.05 ＜0.05

實時熒光定量PCR 檢測轉染前后細胞株let7a 表達結果：A549 細胞和A549/DDP 細胞總RNA 經提取后，經紫外分光光度檢測其純度。結果A260/A280 的比值為1.58 和1.55，說明總RNA 純度較高。RT-PCR 檢測轉染前后let7a 在NSCLC 細胞株的表達結果顯示，轉染后let7a在A549/DDP細胞中的表達水平顯著低于在A549 中的表達水平，A549/DDP細胞表達水平是A549 細胞的(25.54±2.90)%，差異有統計學意義(P＜0.05)。

討 論

肺癌居我國惡性癌癥發生率的榜首，發病率、死亡率均逐年升高，肺癌中又以非小細胞肺癌最為多見，占肺癌發生的80%[3]。非小細胞肺癌早期癥狀并不典型，主要表現為胸部脹痛、低熱、反復咳嗽，易與呼吸道疾病混淆，故患者常忽略癥狀，待發現時癌細胞已向其他器官擴散，錯過治療的最佳時機。

臨床上現用于治療非小細胞肺癌的藥物主要為鉑類藥物，包括一代順鉑，二代卡鉑、奈達鉑、環鉑，三代奧沙利鉑、洛鉑[4]。順鉑是多種實體瘤的一線用藥，是化療藥物中高效高毒的典范，居化療藥物第一位，療效客觀，抗癌譜廣。順鉑是鉑的無機金屬絡合物，順鉑進入細胞后與氯離子發生水合，增加了對靶細胞的攻擊性，通過與細胞核DNA堿基的結合，破壞DNA 基本結構，導致DNA 不能進行正常的復制，抑制細胞的增殖。有相關研究表明，順鉑還可以誘導細胞產生ROS，濃度的增高，會氧化細胞，破壞其正常的生物學功能[5]。順鉑藥物在使用前期治療效果非常好，但是后期容易產生繼發性耐藥，導致相同劑量的順鉑治療效果不佳，但是增加劑量又會對多個臟器產生嚴重的毒性，包括腎毒性、消化道反應、耳毒性、骨髓抑制等。因而如何降低順鉑藥物繼發性耐藥是我們未來亟需解決的問題[6]。

Let7 是2000年Reinhart 在秀麗隱桿線蟲中發現的一種微小RNA(miRNA)，是一個具有莖環折疊結構的核苷酸前體分子，具有高度的時序性、保守性和特異性，一共存在13 種家族[7]。在調節腫瘤細胞基因表達上起著重要的作用。Let7可以作為腫瘤診斷標記物之一，也可以在治療、用藥、預后等方面作為參考標準。在不同的腫瘤中let7發揮作用不同，目前在非小型肺癌中主要參考let7a。let7a重點應用于對肺癌的早期診斷與治療[8]。已有相關研究表明，let7a 的高表達可以增強腫瘤細胞對藥物的敏感性，減少大劑量藥物對正常細胞的殺傷性。Let7a在肺癌早期即能檢測到其表達水平的降低，并在治療過程中發揮對腫瘤的抑制作用，并增加對藥物的敏感性[9]。

本研究中，通過對比A549 與A549/DDP 轉染前后let7a 表達現象以及細胞的增殖能力和細胞克隆數目可得出，A549內let7a低表達會導致A549細胞ic50值升高，對順鉑的敏感性下降，A549 產生耐藥性。A549/DDP 內let7a 高表達會導致A549/DDP細胞ic50值下降，對順鉑的敏感性增加。在細胞平臺克隆實驗中，A549/DDP的let7a高表達會使細胞克隆數減少，細胞增殖能力降低；而A549 中let7a 的低表達會使細胞克隆數增加，細胞增殖能力增加。上述結果證明let7a 作為抑癌基因，其表達水平能夠影響細胞的增殖、凋亡以及順鉑的耐藥性。

綜上所述，let7a 在非小細胞肺癌順鉑耐藥中可能起著非常關鍵的作用。let7a 有可能成為肺癌治療的介入靶點，為肺癌的治療提供全新用藥模式，也為研究非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用及相關機制提供了新的思路和途徑。