小粒咖啡樹咖啡堿合成途徑中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1表達差異及其與咖啡堿含量的相關性

李芬 李麗江 徐丹旎 陳春林 王瑋 李梅

（1. 滇西應用技術大學普洱茶學院，普洱 665000；2. 云南省農業科學院茶葉研究所，勐海 666201）

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea genus）植物，該屬主要為二倍體和四倍體［1］。主要種植的有小粒種（Coffee arabica）、中粒種（Coffee robusta）和大粒種（Coffee liberica）［2-4］。其中，由于小粒種咖啡品質較好，生產規模較大，其產量達到全球咖啡產量的73%，已成為很多地區獨具優勢的特色經濟產業。

咖啡中含有咖啡堿，適量攝入對身體有益，過多則有害。咖啡樹中，咖啡堿主要在嫩葉中合成。咖啡幼苗的葉片和子葉含咖啡堿，而根部和成熟枝條的褐色部分不含咖啡堿［5］。目前，從咖啡樹中已克隆獲得一系列與咖啡堿合成相關的關鍵酶基因，包括7-黃嘌呤核苷甲基轉移酶基因（7-methylxanthosine synthase，CaXMT1）［6］、可可堿合成酶基因CaMXMT、咖啡堿合成酶基因（Coffee caffeine synthase，CaDXMT1）［7］和雙功能酶基因（Bifunctional coffee coffeine synthase，CCS1）［8］等。盡管這些酶的氨基酸系列組成具有很大的相似性（＞80%），但是底物專一性差異性較大［6］。

目前，對小粒咖啡樹不同組織不同發育時期（嫩葉、成熟葉片、幼果和成熟鮮果）CaXMT1、CaDXMT1、CCS1相對表達量差異，以及這3個關鍵基因的表達與咖啡堿含量關系的研究報道甚少。

本研究采用qRT-PCR方法測定咖啡樹不同組織中咖啡堿合成途徑3個關鍵酶基因（CaXMT1、CaDXMT1和CCS1）的相對表達量，并將其與各組織中的咖啡堿含量進行相關性分析，從而探究這3個基因的mRNA相對表達量與咖啡堿含量的關系，進一步探討小粒種咖啡豆中咖啡堿合成機理，為咖啡樹的育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年11月，在云南省普洱市南島河進行樣品采集，采集生長狀況一致的小粒種（Coffeearabica）咖啡品種植株嫩葉、成熟葉片、幼果和成熟鮮果4個部位。采摘后，每個部位選取部分樣品置于液氮中冷凍，之后于-80℃保存；剩余樣品干燥至恒重，用研磨機研磨至粉末狀，并過200目篩，聚乙烯自封袋密封備用。

1.2 方法

1.2.1 小粒咖啡樹不同部位咖啡堿含量的HPLC測定

（1）樣品提取 按照HPLC測定植物樣中咖啡堿含量的樣品提取方法［9-10］，稱取0.167 g粉末狀樣品，放入15 mL離心管中，加入10 mL超純水。將離心管放入水浴鍋中100℃浸提20 min。然后4 000 r/min離心5 min。提取上清液至50 mL容量瓶中，定容至50 mL。經0.22 μL水系濾膜過濾，-20℃保存。

（2）HPLC色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-H（4.6×250 mm）；流動相：甲醇∶水（40∶60）；柱溫40℃；進樣量10 μL；流速0.5 mL/min；檢測波長280 nm；進樣時間：15 min。

1.2.2 關鍵酶基因的qRT-PCR檢測

（1）RNA提取及cDNA合成 選取小粒咖啡各部位樣品，分別加入PVPP及液氮充分研磨；各取約20 mg研磨試樣，加入900 μL CTAB提取液及50 μL β-巰基乙醇，65℃ 30 min；用 RNA 提取試劑盒提取總RNA。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa D6110S）合成第一鏈cDNA。

（2）基因表達量測定 qRT-PCR反應體系（20μL）為 SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa DR081A）10.0 μL、PCR forward ＆ reverse primer（10 μmol/L）各 0.8 μL、cDNA 1st Strand（100 ng/μL）2 μL 和 ddH2O 6.4 μL。qRT-PCR 程序為 95℃ 30 s；95℃ 5 s，62℃ 30 s，40個循環。在65-95℃建立溶解曲線。以GAPDH作為內參基因［11］，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

1.2.3 數據處理 采用Microsoft Excel 2013、SPSS及Origin8.5軟件分析處理試驗數據。

表1 小粒種咖啡樹咖啡堿合成途徑3個關鍵酶基因的引物序列

2 結果

2.1 小粒咖啡樹不同組織咖啡堿含量的HPLC法測定

咖啡堿出峰時間為8.85 min。色譜峰面積（y）與濃度（x，mg/mL）的線性回歸方程為y=2.10×105x+6.70×105，r2=0.999 4。云南小粒種咖啡植株中的咖啡含量范圍為0.62%-1.52%，其中，成熟葉片中的咖啡堿含量最低，嫩葉中的最高（表2，圖1），達到1.22%±0.18%，嫩葉中的咖啡堿含量是成熟葉片中的1.8倍。小粒種咖啡植株不同組織不同發育時期咖啡堿含量順序表現為嫩葉＞幼果＞成熟鮮果＞成熟葉片，且嫩葉和幼果中的咖啡堿含量分別顯著高于成熟葉片（P=0.001）和成熟鮮果（P=0.007）中的。

2.2 小粒咖啡樹不同組織間3個關鍵酶基因的表達量差異

由表3可知，云南小粒種咖啡中的CCS1相對表達量范圍為1.03-2.38，不同組織的CCS1相對表達量順序為嫩葉＜成熟葉片＜幼果＜成熟鮮果；CaDXMT1的表達量范圍為1.08-2.82，不同組織的相對表達量順序為嫩葉＜成熟葉片＜成熟鮮果＜幼果；CaXMT1相對表達量范圍為1.34-2.29，不同組織的相對表達量順序為：嫩葉＜幼果＜成熟葉片＜成熟鮮果。CaXMT1和CaDXMT1在嫩葉和成熟葉片中的相對表達量存在極顯著性差異（P＜0.01），而幼果和成熟鮮果之間僅僅只有CaXMT1存在極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 小粒種咖啡樹不同組織咖啡堿含量

表3 小粒種咖啡樹咖啡堿合成途徑3個關鍵酶基因的相對表達量

2.3 基因表達量與咖啡堿含量的相關性分析

由圖2可知，CaXMT1在成熟葉片和成熟鮮果中的相對表達量隨著咖啡堿含量的增加而增加，其相關系數R2分別為0.25和0.15。然而，CaXMT1在嫩葉和幼果中的相對表達量隨著咖啡堿含量的增加而呈降低趨勢，其相關系數分別為0.30和0.93，且在幼果中顯著負相關（P=0.004）。

CaDXMT1相對表達量在嫩葉、成熟葉片、幼果和成熟鮮果中的相對表達量隨著咖啡堿含量的增加均呈增加趨勢，其相關系數R2分別為0.20、0.067、0.33和0.084。

CCS1在嫩葉和成熟鮮果中的相對表達量隨著咖啡堿含量的增加而呈增加趨勢，其相關系數R2分別為0.15和0.32。而在成熟葉片和幼果中則隨著咖啡堿含量的增加呈現降低的趨勢，其相關系數R2分別為 0.29和0.24。

圖2 小粒種咖啡樹咖啡堿合成途徑關鍵酶基因CaXMT1、CaXMT1及CCS1相對表達量與咖啡堿含量的相關性

3 討論

本研究中云南小粒種咖啡植株葉片咖啡堿含量范圍為0.62%-1.52%，均值為0.94%±0.32%；果實中為0.84%-1.18%，均值為0.98%±0.10%；前人研究結果表明，小粒咖啡的大多數品種的咖啡豆中咖啡堿含量約為1.0%。本研究結果與前人報道的含量相符［12］。植物中的咖啡堿99%存在于葉片中［13-15］，且植物中咖啡堿合成的主要部位是葉綠體，合成后的咖啡堿與綠原酸結合成復合物儲存在細胞液泡中［16-17］，根和莖中幾乎不能合成咖啡堿［18］，植物中咖啡堿不同組織含量分布規律為幼嫩新梢＞莖梗＞花果［19］。葉片中咖啡堿的合成主要在幼葉中進行，隨著葉齡的增加，合成速率降低［15］。

本研究發現除了CaXMT1在嫩葉和幼果中的相對表達量分別顯著低于成熟葉片和鮮果（P＜0.01）中的，且在幼果中相對表達量與咖啡堿含量顯著負相關（R2=0.93，P＜0.01）以外，其他基因的相對表達量在嫩葉和成熟葉片、幼果和成熟鮮果中的差異性不明顯。3個關鍵酶基因在不同組織不同發育時期表達的差異性，可能與這3個酶的特性以及咖啡堿合成途徑中關鍵酶基因調控機制的復雜性相關［6-8，20-21］。在咖啡堿合成過程中，主要包括4個反應步驟（表4）、3個甲基化反應步驟及一個脫核苷反應步驟。咖啡堿合成過程中，首先是在N7甲基轉移酶（CmXRS1和CaXMT1）的催化下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，黃嘌呤核苷合成7-甲基黃嘌呤核苷［21］。其次是在脫核苷酶的催化下，7-甲基黃嘌呤核苷脫核苷，目前，脫核苷酶基因未被克隆［22-23］，估計7-甲基轉移酶在催化黃嘌呤核苷甲基化的同時，催化7-甲基黃嘌呤核苷脫除核苷［24］。然后，在N3甲基轉移酶基因CTS和CaMXMT的調控下，7-甲基黃嘌呤合成可可堿（3，7-二甲基黃嘌呤）［20-21］。最后，可可堿在N1甲基轉移酶基因（CCS1和CaDMXT1）的調控下合成咖啡堿［6］。

這些咖啡堿合成關鍵酶基因的氨基酸序列相似性（＞80%）較大，且其分子量及編碼的多肽氨基酸組成個數差異性小，底物專一性卻差異較大［6］。如黃嘌呤核苷甲基轉移酶基因（XMT/CmXRS），其編碼的多肽由372個氨基酸組成，且分子量為41.8 kD。可可堿合成酶基因MXMT1（42.7 kD）、MXMT2及CTS2（43.4 kD），其編碼的多肽分別由378、384個氨基酸組成，多肽分子量及氨基酸組成個數相似，但催化特性差異性大。可能與不同的酶具有不同的催化特性有關，而酶的催化特性與其動力學參數Km相關性較大。如咖啡堿合成酶DXMT和CCS1，其編碼的多肽分子量（43 kD）及氨基酸個數（384）相同，但其動力學參數差異性較大，在調控可可堿合成咖啡堿的過程中，其動力學參數Km值分別為1 200和 157 μmol/L，DXMT的Km值 是CCS1的 8倍［8，20-21］。而且，CCS1能夠利用7-甲基黃嘌呤、3，7-二甲基黃嘌呤及1，7-二甲基黃嘌呤合成咖啡堿，具有N1及N3甲基化的雙功能［21］，其中，1，7-二甲基黃嘌呤為其最活躍的底物，對1，7-二甲基黃嘌呤的催化活性是對可可堿的3倍［26-27］。但在咖啡植物中1，7-二甲基黃嘌呤的含量較少。因此，咖啡堿的合成主要是7-甲基黃嘌呤通過合成可可堿而合成咖啡堿。進一步研究發現咖啡堿合成途徑中的幾個關鍵酶基因在細胞中既可以形成同源二聚體，也可形成異源二聚體，且檢測異源二聚體有雙重活性，這可能是有利于咖啡堿的快速合成［28］。通過咖啡堿合成途徑中幾個關鍵酶特性的差異性，可知咖啡堿的合成途徑是一個復雜的過程，與酶底物的可利用性以及濃度等密切相關［6-8，20-21］。

表4 咖啡堿合成途徑中的N-甲基轉移酶及編碼基因［25］

咖啡堿合成途徑中的3個甲基化反應，需要有嘌呤環、甲基供體以及甲基載體四氫葉酸。植物中咖啡堿的量，除了與這3個關鍵酶基因的相對表達量，可能還與嘌呤環、甲基供體以及甲基載體四氫葉酸的合成量相關。咖啡堿結構中的甲基和黃嘌呤核苷分別經過不同的途徑組合，目前已發現的黃嘌呤核苷的合成可通過4條途徑［29］，分別是核糖-5-磷酸途徑、腺嘌呤核苷酸途徑、鳥嘌呤核苷酸途徑和S-腺苷甲硫氨酸循環途徑。其嘌呤環的合成途徑中受多種酶基因的調控，Fujimori等［30］研究表明，腺嘌呤核苷脫氨酶促進腺嘌呤核苷酸合成嘌呤環進而提高咖啡堿的合成量。咖啡堿結構中的3個甲基由S-腺苷蛋氨酸提供［31］，且在嘌呤環甲基化的過程中，四氫葉酸接受來自S-腺苷蛋氨酸的甲基，變成N5-甲基四氫葉酸，在甲基轉移酶的作用下，攜帶甲基的四氫葉酸將甲基轉移到嘌呤環上去，從而完成甲基化作用［32］，而這一轉甲基的過程中，受到蛋白質代謝的影響［33］，這與蛋白質代謝旺盛的嫩葉中咖啡堿含量最多的現象也相符。

然而，小粒咖啡樹中不同部位咖啡堿的含量除受基因的調控外，還受到光照、溫度、氮素、鉀離子濃度、季節等環境因子的影響。前人應用碳同位素示蹤技術發現，光通過溫度間接影響酶的活性，強光和大量日照，通過加速氨基酸的分解，進而抑制咖啡堿的合成［34-35］。關于季節，研究表明，秋季茶樹新稍中的咖啡堿含量低于春夏兩季［36］。氮肥通過增加氨基酸的含量來增加咖啡堿的合成量［37-38］。鉀肥則通過提高酶的活性來增加咖啡堿的含量［39-42］。海拔也影響咖啡堿的合成，Owuor等［43］研究表明，隨著海拔的增加，茶葉中的咖啡堿含量增加。劉建軍等［44］通過對茶葉進行不同遮陰方式的處理，發現遮陰能夠增加茶葉氨基酸、咖啡堿含量，且不同遮陰方式的增加效果不一樣，其中黑色雙層遮陽網遮蔭效果最好。而鄭高云等［45-46］研究也表明，植物為了預防蟲害，會釋放更多的咖啡堿。

同時，咖啡堿在植物體內的分解也影響咖啡堿在植物體內的含量。咖啡堿在植物體內的代謝，一方面是合成，一方面是分解。咖啡堿的分解先脫去環上的基團，變成黃嘌呤，脫下的甲基又通過四氫葉酸載體轉移到其他化合物中［32］，黃嘌呤有兩種去向，一種是繼續分解，一種是轉化為其它嘌呤核苷酸再被利用。黃嘌呤在茶樹體內的分解主要是在老葉中進行，分解產物主要是尿酸和尿囊素。研究報道，夏季高溫加速蛋白質以及咖啡堿的分解［34］，導致植物體內的咖啡堿含量降低。

4 結論

咖啡堿在幼齡組織中的合成量顯著高于成熟組織中的合成量；合成途徑中的CaXMT1、CaDXMT1、CCS13個關鍵酶基因，在不同組織不同發育時期表達具有差異性。