實時無標記腫瘤細胞凋亡篩選技術體系的建立

李艷偉 宋興輝 王佳佳 劉麗 黃瑩瑩 郭春

（浙江大學醫學院生物化學與分子生物學平臺，杭州 310058）

細胞凋亡（Apoptosis），又稱程序性細胞死亡（Pragrammed cell death），是指在一定的生理和病理情況下，機體為了維持內環境穩定并由基因控制的有序的細胞自主性死亡形式［1-3］，與腫瘤的發生、發展與轉移有密切關系，是研究藥物抗腫瘤作用機制的重要方向［4］。細胞凋亡檢測對于基礎研究和臨床診斷具有重要意義，目前用于體外細胞凋亡檢測的方法很多，流式細胞分析法可對單個細胞或其他生物微粒進行快速定量分析，是定量檢測細胞凋亡的重要方法之一，其中Annexin V/PI 法是目前較為流行的檢測細胞凋亡的方法，具有分析細胞量大、靈敏度高、方便快捷等優點［5-7］。

高通量實時細胞功能分析系統（xCELLigence-RTCA系統）是基于檢測電子傳感器阻抗變化以反映細胞生理狀態的新型細胞分析系統，測定的電阻抗轉化為細胞指數（Cell index）即反映了細胞群體各種生理變化包括細胞生長、形態變化、死亡等一系列生理狀態［8-9］。可在近似生理環境下實現高通量、動態、無標記檢測腫瘤細胞增殖、凋亡等多項生理學功能［10］。

本研究將xCELLigence-RTCA的實時無標記技術和流式細胞術相結合，選擇非小肺癌細胞A549作為靶細胞，以能促進A549細胞凋亡DDP作為靶分子，采用傳統的流式細胞分析技術作為平行對照，初步確定了這種實時無標記技術聯合流式細胞術的篩選體系用于腫瘤細胞凋亡篩選可行性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人非小細胞肺癌細胞株A549（中國科學院上海細胞庫ATCC：Cat No：CCL-185TM）。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清和0.25%胰酶（Gibco）；青鏈霉素（Invitrogen）；胰酶購自（杭州科易生物技術有限公司）；二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）（Sigma）；順鉑（cis-Dichlorodiamineplatinum（II），DDP）（ 阿拉丁）；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit（AP101）（聯科生物）。

1.1.3 儀器設備 高通量實時細胞功能分析系統（xCELLigence-RTCA） 及 E-Plate96孔板（ 杭州艾森生物有限公司）；多色流式細胞分析儀（BD LSRFortessa）；5% CO2恒溫培養箱（Thermo Scientific Cytoperm）；倒置熒光顯微鏡（OLYMBUS CKX31）。

1.2 方法

1.2.1 建立濃度梯度依賴性細胞動力學模型并確定給藥細胞濃度 取凍存的人非小肺癌細胞株A549一管，37℃快速溶解后，加入到培養皿中（已含10 mL培養基），混勻后，置于37℃，5% CO2的孵箱中培養，隔天換液。選取處于指數生長期的A549細胞用0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，吸取10 μL細胞懸液與臺盼藍1∶1混勻，用細胞計數儀計數，配制成終濃度分別為20 000 cells/mL、10 000 cells/mL、5 000 cells/mL、3 000 cells/mL、1 500 cells/mL的細胞懸液。

向E-Plate中加50 μL細胞培養液，檢測培養液基線，將100 μL細胞懸液加入E-Plate，每個濃度設4個復孔，室溫靜置30 min后放入Station，15 min進行一次CI值的測試，連續測試24 h，以細胞CI值為Y軸，以時間為X軸繪制A549細胞生長曲線。

選取同上濃度的A549細胞分別于0 h、24 h進行顯微成像，觀察不同濃度細胞的增殖情況，結合細胞指數特征，確定適合藥物作用的細胞濃度。

xCELLigence-RTCA系統基于微電子阻抗變化監測細胞活性，用細胞指數CI表示，公式如下：

Rb（f）和Rcell（f）分別代表無細胞黏附的電阻抗和有細胞黏附的電阻抗，N代表檢測到電阻抗的頻點數量［11］。細胞鋪板24 h內，經過懸浮、貼壁、潛伏期、增殖并達到覆蓋率為70%-80%的最佳指數生長期，此時細胞指數處于0.5-1范圍內，表示該濃度細胞適合后續的功能性實驗研究［12］。

1.2.2 xCELLigence-RTCA系統檢測不同濃度順鉑對A549細胞增殖的影響 選取指數生長期的A549細胞制成細胞懸液并進行細胞計數，按照xCELLigence-RTCA系統監測確定的細胞密度接種于E-Plate 96細胞檢測板中，每15 min測定一個點，培養26 h后分別加入終濃度為0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/mL的順鉑處理細胞。對照組不予順鉑處理，每個濃度設置3個復孔。繼續動態監測96 h，每5 min記錄1次。以時間為X軸，歸一細胞指數（Normalized cell index，NCI）值為Y軸繪制藥物與細胞的時間/藥物濃度依賴曲線圖譜，觀察不同濃度順鉑對A549細胞增殖的影響，確定順鉑作用的最佳檢測時間點和時間依賴性IC50。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 選取指數生長期的A549細胞，制成細胞懸液并進行細胞計數，按照xCELLigence-RTCA系統監測確定的細胞密度接種6孔板（2.5 mL）中，置37℃、5% CO2條件下培養26 h后，將細胞隨機分為對照組（不予順鉑處理）、順鉑處理組，每個濃度設置3個復孔。根據xCELLigence-RTCA檢測的藥物與細胞的時間/藥物濃度依賴曲線圖譜，選取凋亡曲線出現下降時間點、凋亡檢測中間點、凋亡檢測終點收集細胞，制備密度為1×106cells/mL的細胞懸液，取1 mL于4℃條件下300×g離心15 min，除去上清液，加入Annexin V-FITC結合液195 μL重懸，再先后加入Annexin V-FITC 5 μL 和碘化丙啶染色液 10 μL，在室溫下避光孵育10 min后置于冰浴中，流式細胞儀檢測。

1.2.4 統計學分析 應用SPSS20.0 軟件對數據進行統計分析，實驗數據以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立濃度梯度依賴性細胞動力學模型并確定給藥細胞濃度。

圖1是xCELLigence-RTCA系統實時監測24 h的A549細胞濃度依賴性生長曲線模型。從中發現，系統連續監測24 h，不同濃度的A549細胞指數（CI值）保持繼續增長趨勢，除1 500 cells/mL濃度的A549細胞指數CI值小于0.5外，其他濃度的A549細胞指數CI值均大于0.5。

圖2是不同濃度A549細胞培養24 h的顯微成像圖，與接種0 h相比，培養24 h后3 000 cells/mL濃度的A549細胞密度為70%-80%左右；1 500 cells/mL濃度的A549細胞密度為40%-50%左右；而 5 000 cells/mL、10 000 cells/mL、20 000 cells/mL濃度的A549細胞密度超過90%且細胞的形態出現皺縮。

圖1 實時監測24 h A549細胞濃度依賴性生長曲線模型

綜上兩種實驗結果，選定3000 cells/mL濃度的A549細胞作為后續藥物處理的最佳細胞濃度模型。

圖2 不同濃度A549細胞顯微成像圖

圖3 實時監測順鉑作用A549細胞的時間/藥物劑量依賴性曲線圖譜

2.2 xCELLigence-RTCA動態監測不同濃度順鉑作用A549細胞凋亡情況

A549細胞鋪板增殖生長約26 h后時進行加藥處理，取此時CI值歸一化為1。如圖3所示，系統繼續監測72 h順鉑作用A549細胞的時間/藥物劑量依賴性曲線發現，與對照組相比，順鉑在作用11 h后A549細胞增殖曲線開始出現下降趨勢，作用48 h后所有A549細胞增殖曲線下降，作用72 h后，對照組A549細胞生長曲線開始下降。分析不同時間點順鉑作用的A549細胞存活率，差異顯著（P＜0.05）（圖4）。從圖5發現IC50值在加藥24 h后保持相對穩定，通過xCELLigence-RTCA系統軟件計算順鉑作用 72h 的 IC50值為 2.614 μg/mL（圖 6）。

圖4 不同濃度順鉑作用A549細胞不同時間的細胞存活率

圖5 順鉑作用后的時間依賴IC50值變化圖

圖6 順鉑作用72 h計算的IC50值

2.3 流式細胞術檢測不同濃度順鉑在不同檢測時間點對A549細胞凋亡的影響

圖7為運用流式細胞術檢測順鉑對A549細胞凋亡的影響結果。根據xCELLigence-RTCA系統檢測的順鉑作用A549細胞凋亡結果分析，選取1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 三種濃度順鉑分別處理 A549細胞11、48、72 h，通過流式細胞術進行細胞凋亡率檢測結果如圖7-A所示，與對照組相比：1 μg/mL順鉑作用了11 h、48 h、72 h細胞凋亡率分別為5.47%±0.29、30.4%±0.87、44.2%±0.62。2 μg/mL順鉑作用了11 h、48 h、72 h細胞凋亡率分別為28.27%±0.82、52.73%±0.65、73.43%±1.23。4 μg/mL 順鉑作用了11 h、48 h、72 h細胞凋亡率分別為35%±0.57、79.1%±1.22、95.2%±1.12。

圖7 流式檢測順鉑對A549細胞凋亡的影響結果

2.3.1 不同濃度順鉑作用相同時間的A549細胞凋亡情況 如圖7-B所示，3種濃度順鉑作用11、48、72 h后，與對照組相比，A549細胞的凋亡趨勢明顯，順鉑濃度越高，A549細胞凋亡率增加趨勢越顯著（P＜ 0.05）。

2.3.2 相同濃度順鉑作用不同時間的A549細胞凋亡情況 與對照組相比，從圖7-C統計圖發現：隨著3種濃度順鉑作用時間的增加，A549細胞凋亡趨勢呈顯著性變化（P＜ 0.05）。

2.3.3 xCELLigence-RTCA技術輔助流式細胞術檢測順鉑作用A549細胞的凋亡情況 如圖7-D發現，隨著順鉑濃度的增加或順鉑作用時間的增加，A549細胞的凋亡增加趨勢顯著（P＜ 0.05），與xCELLigence-RTCA系統監測的A549細胞的時間/藥物劑量依賴性曲線結果一致。因此在細胞凋亡檢測實驗中，通過分析xCELLigence-RTCA細胞功能分析系統實時監測的值，可確定細胞凋亡的最佳檢測時間點和藥物濃度，為流式細胞術的凋亡檢測提供可靠的條件。

3 討論

據統計，我國肺癌居于惡性腫瘤死亡率的首位，其中非小細胞肺癌占全部肺癌的80%以上，因此在人均壽命增長的同時，惡性腫瘤已成為人類死亡的首要疾病和因素［13-15］。肺癌早期診斷率極低，因此細胞凋亡檢測對于基礎研究和臨床診斷具有重要意義。流式細胞分析法可對單個細胞或其他生物微粒進行快速定量分析，是定量檢測細胞凋亡的重要方法之一［7］。但是該方法檢測指標單一，僅僅給實驗定格了一個最終結果，往往由于時間點的選取不確定性，而漏掉藥物作用的瞬間反應變化，給細胞凋亡活性檢測帶來了一定的難度，因此選擇合適的檢測時間很重要［16］。

xCELLigence細胞功能分析系統可以進行無標記、實時、動態的監測腫瘤細胞的凋亡變化過程，獲得完整的動態曲線圖譜和細胞指數值，從而確定藥物誘導腫瘤細胞凋亡的給藥時間點和給藥劑量，因此也減少了因流式細胞術在給藥時間和給藥劑量上做的摸索［8-11］。但根據細胞指數值來確定細胞凋亡最佳檢測時間點和給藥劑量的研究，國內外文獻鮮少報道［17］。本研究結合xCELLigence系統監測的順鉑作用曲線和流式細胞術檢測分析結果發現，藥物作用的CI值降低，細胞凋亡趨勢增加。CI值降到最低時，細胞存活率最低。研究還發現不同劑量順鉑誘導后，A549細胞指數達到最低值所需要的時間并不相同，流式細胞術檢測細胞凋亡率的時間點和合適的藥物濃度也不相同，因此藥物劑量和作用時間對細胞凋亡會產生不用的結果，該實驗結果和文獻報道相一致［17］，聯合兩種技術為藥物細胞模型的多種功能研究找到了的新手段，為細胞凋亡檢測的應用開發提供良好的平臺。

4 結論

在細胞凋亡檢測實驗中，xCELLigence-RTCA細胞功能分析系統實時監測的值可用于確定細胞出現凋亡的最佳檢測時間點和藥物濃度。聯合流式細胞術的精準定量技術，確定這種實時無標記細胞凋亡篩選技術體系用于腫瘤細胞凋亡篩選的可行性和可靠性，該技術體系的建立將為藥物誘導腫瘤細胞活性研究方面的應用提供支持和推廣。