人RhoB基因真核表達載體的構建和表達分析

王梅林 牛精鈴 金若其 徐瑩瑩 蔡晶晶 陳群力

（河南科技大學醫學院，洛陽 471023）

小G蛋白是一類廣泛存在于真核生物中的單體GTP結合蛋白，分子量為20-40 kD。小G蛋白家族成員數目龐大，超過150多個，根據其序列結構特征，可被分為5個主要的亞家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran［1-2］。RhoB基因屬于Rho亞家族，該亞家族蛋白在細胞骨架重組、基因表達及細胞周期等的調控中起到重要作用［3］。

RhoB與其同家族成員RhoA和RhoC的氨基酸序列同源性高達86%，生物學功能也有重合，如RhoA、RhoB和RhoC協同調控細胞骨架運動［4-5］，但更多的證據顯示，RhoB具有許多獨特于RhoA和RhoC的性質和功能。例如，RhoA和RhoC在細胞中為組成性表達，而RhoB則表現為誘導型表達［6］?？拱┧幬锾幚恚ㄈ珥樸K、洛伐他汀）、紫外線照射、EGF或PDGF刺激等均可使RhoB的表達水平迅速上調［7-11］。又如RhoA和RhoC均可促進細胞增殖，而RhoB具有促進細胞凋亡的功能［12-13］。

RhoB在不同癌癥的發生發展過程中表現出截然不同的功能。例如，在惡性膠質瘤、非小細胞肺癌和前列腺癌等腫瘤中的相關研究顯示，其具有原癌基因的功能，可以促進腫瘤細胞的生長或遷移［14-16］。而在腎細胞癌和胰腺癌等癌癥中，RhoB表現出抑癌基因的性質，其蛋白表達水平呈下降趨勢［17-18］。因此，深入研究RhoB蛋白的生理功能尤其是在癌癥發展進程中的功能具有十分重要的意義。本實驗旨在擴增人RhoB基因的ORF序列，構建獲得真核表達質粒Flag-RhoB，并研究所構建質粒在真核細胞的表達情況和細胞亞定位，旨為進一步研究RhoB蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 人乳腺癌MCF7細胞、宮頸癌HeLa細胞、結直腸癌HCT116細胞、水貂肺上皮細胞Mv.1.Lu細胞、菌株DH5α為本實驗室保存；真核表達載體pCMV5作者實驗室保存并改造，在多克隆位點前插入了Flag標簽的編碼序列。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒、PrimeScrip Ⅱ 1st Strand cDNA合成試劑盒、質粒抽提試劑盒和膠回收試劑，TaKaRa公司；1 kb plus DNA ladder，天根公司；pfuDNA聚合酶、dNTP、SalⅠ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶、標準蛋白marker，Fermentas公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS），Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）、Flag M2抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG和Alexa FluorR 488標記的羊抗兔IgG，DAPI，Sigma公司；Lipofectamine 3000，Texas red-phalloidin，Thermo Fisher公司；酵母粉、蛋白胨和ECL顯色液，廈門鷺隆生物科技有限公司；氨芐青霉素、Trypsin以及其他化學試劑均購自上海生工。

1.1.3 儀器設備 PCR儀、核酸電泳儀、蛋白電泳及轉膜系統、ChemiDoc XRS+ 化學發光成像系統，Bio-Rad；CO2培養箱、制冰機、-80℃冰箱，SANYO；GSD-8000成像及分析系統，美國UVP；NanoDrop 2000超微量分光光度計、微量臺式高速離心機，Thermo Fisher；氣浴恒溫振蕩器，金壇市迅生儀器廠，A1R/A1激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人HEK-293T細胞總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 培養在6孔板匯合度為90%的HEK-293T細胞，1×PBS洗一次；加入0.5 mL的RNAiso Plus，輕輕搖勻，然后使用移液槍吹打細胞使其脫落；轉移至離心管中，用移液槍反復吹吸至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5 min。加入氯仿0.1 mL，蓋緊離心管蓋，用手劇烈震蕩15 s，待溶液充分乳化無分相現象后，再室溫靜置5 min。12 000 r/min 低溫離心15 min。吸取上清液0.15 mL，加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管混勻，在室溫靜置10 min。12 000 r/min 低溫離心10 min。取出試管后小心棄去上清，緩慢的沿離心管壁加入75%的乙醇1 mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 r/min 低溫離心5 min后小心棄去乙醇。開蓋室溫干燥沉淀3 min，加入20 μL RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后直接反轉錄。

cDNA第一鏈的合成過程如下。在PCR管中首先配置下列反應混合液：Oligo dT引物 2 μL，dNTP混 合 物（10 mmol/L）2 μL，RNA 2 μL，RNase free水 4 μL。65℃ 變性5 min后，冰上迅速冷卻。簡短離心后，繼續配置逆轉錄反應液：上述變性后反應液 10 μL，5×PrimeScriptTMⅡ緩沖液 4 μL，RNase 抑制劑 0.5 μL，逆轉錄酶 1 μL，RNase free 水 4.5 μL。緩慢混勻后簡短離心。42℃ 逆轉錄30 min。70℃ 酶滅活15 min后冰上冷卻待用。

1.2.2 獲得RhoB基因片段 從GenBank數據庫中獲得人RhoB基因的mRNA序列，DNAMAN軟件對該序列進行限制性酶切圖譜分析，設計引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所設計的上游引物序列為5'-GCCGGGTCGACAAGCGGCCA TCCGCAAGA AGC -3'，包含限制性內切酶SalⅠ的識別位點；下游引物序列為5'-GCGTCTAGA TTATAGCACCTTGCAGCAGTTGA -3'，包含限制性內切酶XbaI的識別位點。培養HEK-293T細胞，收集并提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA，PCR擴增RhoB基因。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性35 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環；最后72℃延伸7 min。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。割膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，用于后續連接。

1.2.3 真核表達重組質粒Flag-RhoB的構建及雙酶切鑒定 將PCR產物純化以利于后續酶切。純化方法為 ：取 45 μL PCR 產物加入 5 μL NaAc（3 mol/L）和100 μL無水乙醇，混勻后-20℃沉淀1 h；沉淀后離心，12 000 r/min 10 min；棄上清，沉淀用70%無水乙醇洗2次，35 μL無菌水溶解沉淀備用。

取 15 μL 回收的 PCR 產物和 1 μg pCMV5空載體用SalⅠ、XbaⅠ雙酶切，37℃，3 h。酶切體系如 下 ：SalⅠ 0.5 μL，XbaⅠ 0.5 μL，10×buffer 4μL，加入PCR產物或空載體后用水補至40 μL。

酶切后電泳回收，T4 DNA連接酶進行連接（16℃，6 h），連接產物轉化感受態細胞DH5α涂布于LB平板，平板含有氨芐青霉素（Amp+）。37℃培養過夜后挑取單克隆，牙簽法小提質粒并用雙酶切篩選符合預期的克隆。將符合預期的克隆再次轉化DH5α挑單克隆培養后用堿裂解法提質粒，用SalⅠ和XbaⅠ再次雙酶切檢測，檢測符合預期的重組子送南京金斯特生物工程有限公司進行測序鑒定。

1.2.4Flag-RhoB表達產物的Western Blotting鑒定 將重組質粒用脂質體轉染密度為70%的乳腺癌MCF7細胞、宮頸癌HeLa細胞或結直腸癌HCT116細胞，轉染6 h后換液，24 h后裂解細胞，提取總蛋白并測定濃度，取25 mg蛋白進行Western Blotting分析。用12%的SDS-PAGE凝膠進行電泳分離后轉膜（PVDF膜，400 mA，1.5 h）。5%的BSA室溫封閉30 min；5% BSA配制的Flag一抗室溫孵育1 h；TBST buffer洗3次，每次5 min；1% BSA配制的二抗室溫孵育1 h；TBST buffer洗3次，每次5 min；加入ECL顯色液，用化學發光成像系統檢測。

1.2.5 Flag-RhoB表達產物的免疫熒光分析 6孔細胞培養板中放入潔凈蓋玻片，接種Mv.1.Lu細胞，接種密度為5×104/孔，培養12 h后轉染；轉染24h后PBS洗2遍，4%的多聚甲醛室溫固定15 min；PBS洗2遍，0.25% Triton X-100室溫通透5 min；PBS洗2遍，5%的BSA室溫封閉30 min；Flag抗體按1∶200稀釋，室溫孵育2 h；PBS洗4遍，避光條件下，Alexa Fluor 488標記的驢抗兔二抗室溫孵育1 h；PBS洗4遍，5 μg/mL Phalloidin（使用前用PBS新鮮配置）室溫孵育30 min；PBS洗4遍，避光條件下，1 μg/mL DAPI（使用前用PBS新鮮配置）室溫孵育5 min；PBS洗兩遍，封片，鏡檢。RhoB蛋白的表達用Flag抗體檢測，人IgG作陰性對照，Phalloidin染色顯示細胞骨架，DAPI染色顯示細胞核結構。

2 結果

2.1 人HEK-293T細胞cDNA的合成

提取HEK-293T細胞總RNA，電泳結果（圖1）顯示成功獲得高純度的總RNA。使用PrimeScripⅡ 1st Strand cDNA合成試劑盒進行反轉錄，制備人HEK-293T細胞cDNA。

圖1 人HEK-293T細胞總RNA的提取

2.2 RhoB基因的擴增

以制備好的cDNA為模板，以設計好的引物PCR擴增RhoB基因，電泳結果顯示擴增出的片段大小約為590 bp，大小符合預期（圖2）。

圖2 RhoB基因PCR產物電泳圖

2.3 重組質粒Flag-RhoB的構建和酶切鑒定

用SalⅠ和XbaⅠ同時將擴增獲得的目的片段和pCMV5空載體酶切處理，膠回收后連接并轉化大腸桿菌DH5α瓊脂糖凝膠電泳結果（圖3）顯示，雙酶切后的載體和片段大小分別為4.8 kb（載體）和590 bp（目的片段），符合預期。測序結果顯示連入的RhoB基因與GenBank上的序列完全一致，表明重組質粒構建成功。

圖3 重組質粒SalⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定圖

2.4 Western Blotting檢測重組質粒Flag-RhoB表達情況

將空載體和重組質粒Flag-RhoB分別轉染MCF7細胞、HeLa細胞或HCT116細胞進行Western Blotting分析。結果（圖4）顯示，轉染了重組質粒的樣品中檢測到大小約為25 kD的蛋白條帶，而轉染了空載體的對照組無任何信號。說明插入載體的RhoB基因成功表達，且表達良好。

圖4 重組質粒在細胞中的表達檢測

2.5 免疫熒光檢測重組質粒Flag-RhoB表達情況

將重組質粒Flag-RhoB轉染Mv.1.Lu細胞，細胞免疫熒光實驗初步分析RhoB蛋白在Mv.1.Lu細胞中的定位情況。免疫熒光結果（圖5）顯示，Flag抗體可以檢測到較強的熒光信號，說明重組質粒表達良好。結果顯示RhoB在細胞中主要定位于細胞膜上，少量定位于細胞質中。

圖5 免疫熒光檢測RhoB在細胞中的定位

3 討論

盡管RhoB在腫瘤發生發展過程中表現出兩面性［4］，但筆者認為更多的數據支持RhoB抑癌基因的特性。例如，Calvayrac等［19］研究發現定位于細胞質中的細胞周期蛋白激酶抑制因子p27Kip1通過結合并抑制RhoB蛋白的活性促進非小細胞肺癌的發生。Zou等［20］報道過表達RhoB通過上調PP2A的表達水平導致AKT1的去磷酸化失活，進而抑制骨肉瘤細胞的肺轉移。

另有文獻報道，敲低內源的RhoB后，人胃癌細胞NUGC-3對抗癌藥物表現出明顯的藥物不敏感性［21］，人咽喉癌細胞也表現出對順鉑的抗藥性［22］。這些研究表明某些癌癥在治療過程中出現的抗藥性很可能是由于RhoB表達量下調引起的，提示可以在癌癥治療過程中人為提高RhoB的表達量或者以RhoB為靶點篩選合適的抗癌藥物。因此，深入闡明RhoB活性調控方式或者鑒定新的RhoB特異性效應因子有可能為癌癥提供有效的治療靶點。

本實驗通過PCR技術構建了上游帶有Flag標簽的RhoB真核表達質粒，可以方便開展有關RhoB的功能研究。將該質粒轉染MCF7細胞、HeLa細胞和HCT116細胞，Western blotting結果表明該質粒在細胞中可以順利表達。免疫熒光實驗可以幫助判斷過表達的RhoB在細胞中的亞定位，結果顯示其主要定位于細胞膜上，胞質和胞核中也有少量分布。

在該質粒構建過程時，RhoB基因的3'端選擇的是限制性內切酶XbaI。該酶的識別序列為TCTAGA，與RhoB基因的終止密碼子TGA相連會產生一段TGATCTAGA序列。這段序列中含有GATC序列，所以需要考慮到原核生物Dam甲基化的問題。所以在設計引物時，將RhoB的終止密碼子替換成了TAA，以避免GATC序列的產生。

4 結論

成功擴增出長度為590 bp的RhoB基因的ORF序列，并成功將其連入真核表達載體pCMV5。將重組真核表達質粒Flag-RhoB轉染細胞后，能夠表達出大小為25 kD的蛋白。通過激光共聚焦顯微鏡觀察到RhoB在細胞中主要定位于細胞膜上。