抗癌藥物埃博霉素的生產及工藝發展

田露 薛仁政 張志敏 薛春仙 沈蘭芳 龔國利

（1. 陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021；2. 陜西省微生物研究所，西安 710043）

埃博霉素是一類以16元大環內脂為中心體的天然細胞毒性化合物［1］，到目前為止已有6種埃博霉素及其衍生物被報道（圖1）。1993年德國生物技術研究中心（GBF）的H?fle等［2］首先從南非的一處河灘土壤中分離得到了一株具有細胞毒性及抗菌活性的黏細菌——纖維堆囊菌So ce90菌株。兩年后，默克研究院的Bollag等［3］在大規模篩選微管抑制劑時發現并命名了這種具有抑菌活性的物質，即埃博霉素A和B。埃博霉素主要通過在低濃度條件下誘導微管蛋白在沒有鈣離子、微管偶聯蛋白及三磷酸鳥苷（Guanosine triphosphate，GTP）的情況下，同微管蛋白N端第31位氨基酸與217-231位氨基酸結合，從而促進三磷酸鳥苷依賴性微管蛋白聚合形成穩定微管［4-6］。這也就導致了腫瘤細胞內的紡錘體出現異常，進而使有絲分裂過程中的分離受阻，由此達到抑制腫瘤細胞的功效。

埃博霉素也可通過和其他藥物聯合從而殺滅癌細胞，對耐紫杉醇等藥物的癌細胞也具有良好的療效，一些全合成的埃博霉素衍生物不僅可以抑制惡性腫瘤的生長，甚至還可以使惡性腫瘤收縮乃至消失［7-8］。然而天然的埃博霉素在細胞體內具有毒性高、選擇性差、易產生耐藥性等缺點，且國內目前還沒有達到大規模工業化生產埃博霉素的條件，但其巨大的藥用價值及市場前景已經引起了生物、醫藥等多個領域的高度重視，未來極有可能成為繼紫杉醇之后的又一高效抗癌藥［9-16］。已有一個埃博霉素藥物伊沙匹隆（Ixabepilone）由美國食品藥品管理局（FDA）批準成為第一個上市的埃博霉素藥物IXEMPRA，標志了埃博霉素抗癌新藥開發的重大成就。

圖1 埃博霉素主要化合物的結構

1 埃博霉素的合成

1996年，Gerth等［4］首先通過天然的纖維堆囊菌So ce90菌株生產出了埃博霉素A和B，其產率分別達到22 mg/L和11 mg/L，但后來的許多研究小組均未能成功復現其結果，并且這一產率也遠遠不能滿足工業化生產埃博霉素的需求。因此，研究人員針對如何通過其他方法來提高埃博霉素及其衍生物的產量展開了漫長的研究，主要通過以下幾種方法進行合成。

1.1 化學合成法

自Gerth等［4］由黏細菌的次級代謝產物中發現埃博霉素以來，除了通過常規的生物合成法來制備埃博霉素以外，因其相對簡單的化學結構也使得人們不斷嘗試利用化學合成法來制備埃博霉素，并試圖通過全合成和化學修飾來獲得其衍生物。目前已知的埃博霉素化學合成法大約有30余種，其中典型的包括羥醛縮合成環法、烯烴復分解成環法和內酯化成環法等。然而由于目前已建立的化學合成法其合成路線都十分冗長、分離提純成本極高且產率較低，真正具有商業價值的化學合成路線并不多［17］。

另外，盡管目前通過化學合成法合成埃博霉素及其衍生物的技術已經相對成熟，但改變這些天然產物的骨架仍是一項重大挑戰。基于此，德國的Müller［17］曾提出一種通過化學改造改變這些天然產物骨架的替代方法——通過基因工程技術在闡明生產該有機體的理論基礎上，設計出合理的生物合成途徑，并將其稱為“組合生物合成法”，特別是與半合成方法相結合來改變其天然產物的結構。同時，在了解了控制該生物合成調節機制的基礎上，可進一步提高天然產物中埃博霉素的產量，或是將整個基因簇轉移到異源宿主中，以更好地進行遺傳改良及過表達來提高埃博霉素的產量。

1.2 生物合成法

由于埃博霉素只是黏細菌正常生命活動過程中的一種次級代謝產物，這也決定了天然細菌中埃博霉素的含量較低；另一方面，化學合成法的技術雖然已經相對成熟，但復雜的分離提取過程卻使得工業化生產埃博霉素變得遙遙無期。因此，不少研究人員試圖通過克隆微生物天然產物生物合成基因簇并使其在合適的宿主中異源表達來優化埃博霉素的生產或產生新的衍生物［18-19］。截至目前，已發現的可用于生物合成埃博霉素的異源宿主主要有共色鏈霉菌、委內瑞拉鏈霉菌、大腸桿菌、腐敗假單胞菌和黃色黏球菌等［20-21］。

2000年，Tang等［22］首先克隆并測序了在含細胞毒性的纖維堆囊菌中負責埃博霉素生物合成的基因簇，這些基因簇共編碼一個負載模塊、一個非核糖體肽合成酶模塊、8個聚酮合成酶模塊和一個P450環氧化酶組成，其中P450環氧化酶用于將脫氧-埃博霉素轉化成埃博霉素（圖2），這些基因在共色鏈霉菌中共同表達并產生了埃博霉素A和B，由此證明了共色鏈霉菌可用于菌株改良，且生長速度比天然生產者快10倍。通過將65.4 kb的包涵了整個埃博霉素基因簇的纖維素鏈球菌DNA插入到黃色黏球菌的染色體中由此制得了可產埃博霉素A和B的菌株，并通過構建含埃博霉素突變的P450環氧化酶菌株，成功生產出可產埃博霉素C和D的菌株［23-24］。

圖2 埃博霉素生物合成基因簇的遺傳圖譜

相比于天然生物合成法和化學合成法，通過基因工程修飾后的異源宿主產出埃博霉素的能力無論是從純度還是產量方面都有了質的提升，然而由于埃博霉素對異源宿主產生的細胞毒性使得異源宿主的產量仍無法達到工業化生產埃博霉素的需求。因此，如何進一步提高埃博霉素在異源宿主中的產量無疑成為了國內外當下研究的熱點。

1.2.1 啟動子對異源宿主生物合成產量的影響 通過RNA聚合酶識別并結合啟動子DNA序列來啟動基因轉錄作為轉錄的分子調控機制之一，這提示我們可通過啟動子使宿主的異源基因過表達從而提高產量。然而由于迄今為止關于埃博霉素生物合成啟動子的研究仍相對較少，黃黏球菌作為提高埃博霉素產量的最佳宿主之一，也正是因為缺乏有效的啟動子從而阻礙了其產量進一步提升的空間［25］，因此，如何選擇和設計一種有效的啟動子來提高埃博霉素產量也是當前的研究熱點之一。

2018年，Yue等［25］用兩個內源強啟動子P-pilA和P-groEL1替換黃色黏球菌埃博霉素生物合成基因簇的原始啟動子P-epo，相比于只在穩定期起作用的原始啟動子，兩個內源強啟動子的轉錄能力雖然在生長階段很強，但在生長后期卻大幅降低，綜合產量仍低于前者。但若進一步通過串聯重復啟動子而轉錄整個埃博霉素基因簇（其模式雖與P-epo相似，但在促進埃博霉素產生方面明顯高于P-epo），可使總產量從10 mg/L增加到21.8 mg/L，轉錄水平提高近2倍，產量提高約1.8倍，且仍有進一步改進的余地。Yue等［25］的研究無疑證明了不同轉錄方式能顯著地影響啟動子控制埃博霉素基因表達的效率，同時也為在具有有限已知啟動子的宿主中開發有效的啟動子來產生有價值的次生代謝產物提供了獨特的見解。

1.2.2 通過轉座子將基因簇導入異源宿主 轉座子作為基因組中一段可移動的DNA序列，由于其可從原位上單獨復制或斷裂下來，經環化后插入另一位點，并對其后的基因起調控作用，因此常將這一過程用于解釋生物遺傳進化中分子作用引起的一系列現象，同時也為基因工程和分子生物學研究提供了強有力的理論依據［26］。

Fu等［27］在 Bryan等［28］研究的基礎上，發現可通過轉座子將大型轉基因傳遞到異源宿主。他們用基因重組技術來改造埃博霉素基因簇用以在異源宿主中表達，并通過拼接技術成功從兩個克隆基因簇中重構出了58 kb的埃博霉素基因簇，之后用異源宿主中的啟動子替換原埃博霉素的啟動子，從而在異源宿主黃鏈球菌中轉染并表達了工程基因簇，其產量達到了500 mg/L。2017年，Bian等［29］又通過電穿孔技術建立了一個簡單的轉化體系，將來自纖維堆囊菌的56 kb埃博霉素生物合成基因簇通過隨機轉座導入到伯克霍爾德氏菌DSM 7029菌株的染色體中，經檢測共發現兩種啟動子（TN5-KAN和PTET）在該菌株中起作用。在經過培養基優化、外源甲基丙二酰-輔酶A生物合成途徑的引入和稀有tRNA基因的過表達（宿主改良）使得埃博霉素的總產量增加了約75倍，達到307 μg/L，且產量仍有提升的余地，這一研究也對其他黏細菌性聚酮合成酶和非核糖體肽合成酶的異源表達和加速基因組挖掘過程具有廣泛的指導作用。

1.2.3 CRISPR-dCas9技術在埃博霉素合成中的應用 CRISPR-dCas9基因編輯技術是一種對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，其介導的轉錄激活技術更是一種適用范圍廣泛的可用于提高微生物次級代謝產物轉錄效率的技術［30］。Peng等［31］首先通過優化Cas9密碼子使其與黃色黏球菌相匹配，并通過基因突變使核酸酶失活，從而在黏細菌中構建并激活了用于微生物次生代謝產物生物合成的CRISPR/dCas9激活體系，然后比較了不同酶和激活蛋白對埃博霉素的產生和生物合成基因表達的改善效果，我們確定dCas9激活子的過表達促進了埃博霉素的生成。這也是首例在黏細菌中構建CRISPR/dCas9激活系統并測定其對微生物次級代謝產物生物合成的激活作用的應用實例。

2 生物法合成埃博霉素基礎上的產量提升

無論研究人員通過何種方法來生產埃博霉素或是其衍生物，他們都需要面對如何進一步提升其產量的問題，產量的高低直接決定了其研究成果的普及程度。目前最常見的方法就是通過物理、化學誘變來提高埃博霉素的產量，典型的實例包括美國BMS公司通過傳統的誘變育種技術（紫外及硝基胍誘變）來提高埃博霉素B的產量，國內方面諸如龔國利等［32］通過化學誘變來提升埃博霉素A和B的產量，而除此以外還有一些特殊的方法可用于提高埃博霉素的產量。

2.1 通過全基因組改組育種方法提高產量

對次級代謝產物而言，其合成主要是由微生物細胞內的多酶體系催化完成的，多酶體系中的各個酶由分散或連鎖的結構基因編碼，但由于人們至今仍不了解完整的次級代謝產物合成基因的性質，因此很難通過定向育種完成次級代謝產物產生菌的基因改造，在這樣的背景下Zhang等［33］于1998年在DNA重排（DNA shuffling）育種技術的基礎上提出了全基因重排（Genome shuffling）育種技術，即對原始菌株進行誘變育種從而獲得多個產量有所提高的菌株，在此基礎上構建突變候選株文庫，再將這些表型提高的菌株作為首輪多親本融合的直接親株進行多親株的融合，使其全基因組進行隨機重組，獲得第一代融合株，再以其作為下一輪起始時的原始菌株并重復上述操作，最終從獲得的突變體庫中篩選出性狀被提升的目的菌株。

2012年，龔國利等［34］對全基因組改組育種方法進行了改良——在遞歸原生質體融合的過程中增加了原生質體的誘變過程，并用改良后的全基因組改組育種方法選育埃博霉素B高產菌株，在經過3輪全基因組改組育種后成功選育到了2株遺傳穩定的高產埃博霉素B重組菌株，其中一株重組菌株埃博霉素B的產量達到了42.5 mg/L，相比于原始菌株產量（13.8 mg/L）提高了3倍。這無疑證明了證明改良后的基因組重組技術不僅能有效提高埃博霉素B的產量，且比傳統的基因組重組技術更為高效。

2.2 通過糖基化修飾提高產量

蛋白質的糖基化是一種在蛋白質翻譯后進行修飾的過程，在糖基轉移酶作用下糖被轉移至內質網和高爾基體上的蛋白質，并與蛋白質上的氨基酸殘基相結合形成糖苷鍵，在經過一系列的修飾后可轉化為糖蛋白［35］。

基于此，Gao等［36］提出化學法對該化合物進行半乳糖基化修飾并用發酵法合成埃博霉素B，從而使高活性的埃博霉素選擇性地積聚在腫瘤細胞中，且在正常細胞中的豐度降低，由此達到選擇性殺傷癌細胞的目的，這樣不僅可以降低埃博霉素的毒性，還可提高其對腫瘤細胞的殺滅作用，實現腫瘤細胞的靶向治療。經檢測發現，游離埃博霉素B與半乳糖化埃博霉素B的細胞毒性比為150左右，這也為埃博霉素糖苷靶向治療癌癥提供了一條新思路。

2.3 通過調節細菌負轉錄調節因子提高產量

Yue等［37］通過鑒定埃博霉素生物合成的轉錄調節器ESI發現，它可與埃博霉素啟動子結合以下調基因簇中所有基因的轉錄從而影響埃博霉素的合成，ESI的過量表達抑制了埃博霉素的產生，而該基因的失活促進了埃博霉素的產生，其產量可由9.9 mg/mL增加到13.7 mg/mL，這也是第一個為埃博霉素生物合成鑒定的轉錄調節子。然而，因為ESI基因僅存在于一些黏細菌基因組中所以這一調節方式在黏細菌中并不普遍，并且由于原核生物中沒有組蛋白，其詳細的分子功能模式需要進一步研究。

2.4 通過調節pH值提高產量

Han等［38］通過使用最新的測序技術對So0157-2菌株進行基因組測序，并在不同的pH條件下測量比較其轉錄組。結果顯示，基因組的擴展受多種內部和外部因素影響。但值得注意的是，通過數據分析他們發現通過摻入外源遺傳物質和復制內源基因會出現一種獨特的堿式pH改善途徑，這也證明埃博霉素的產量一定程度上與其pH值有關。

3 發酵液中埃博霉素的分離提取

相比于化學合成法在生產過程中高昂的成本、復雜的制備及分離提取流程，發酵法通過現代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，可以有目的的得到大量純度較高且不含抗原的生物制品。而通過對埃博霉素產生菌纖維堆囊菌進行改造并優化其發酵工藝，一定程度上可以說是現階段工業化生產埃博霉素的最佳途徑，但是由于埃博霉素作為一種次級代謝產物所存在的負反饋抑制和黏細菌在液體環境中存在聚團非均勻生長特性，使得埃博霉素的發酵產量遠低于預期，而在培養過程中加入固相吸附劑無疑是原位提取埃博霉素并進一步提高其發酵產量的方法之一。

3.1 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂作為一種不含交換基團的高分子吸附樹脂，可通過物理吸附從水溶液中選擇性的吸附有機物。因其具有不溶于酸、堿及各種有機溶劑、物理化學性質穩定、吸附量大且吸附速率較快、比表面積大、選擇性好、解吸條件溫和等優點，目前廣泛應用于食品、醫藥、環境等多個領域。而利用大孔吸附樹脂來進行埃博霉素的大規模分離提取就是其在醫藥領域應用的一個典型案例，這也是目前國內應用較為普遍的一個方法。

其中比較出色的包括劉斯淼等［39］通過直接吸附流經HLD-16大孔樹脂的發酵液中的埃博霉素從而達到分離提取的目的，經分離提取后埃博霉素的產量可達到 2.105 2 mg/L；此外，還有張慶林等［40］通過利用大孔樹脂和硅膠層析技術來進行埃博霉素的大規模分離提取，其中埃博霉素B的產量可達到9.9 mg/L，經兩步純化后純度可達到95%；胡瑋等［41］通過利用混合樹脂吸附、固液分步萃取、分子篩層析、結晶和高效液相分離等手段，從黏細菌發酵液中成功分離提取出埃博霉素埃博霉素A和B，其收率達到80%以上。

3.2 多孔陶瓷吸附法

多孔陶瓷材料是一種以剛玉砂、碳化硅、堇青石等為主料、經成型和特殊高溫燒結工藝制備的一種具有高開口氣孔率的多孔性陶瓷材料，除了可以用作諸如催化劑載體、微晶載體和藥劑載體等功能性載體外。因其具有耐高溫、耐腐蝕、極佳的吸附能力和良好的生物、化學惰性等優點，故而也可用于醫藥工業中的疫苗、酶、病毒、核酸、蛋白質等生理活性物質的濃縮、精制和分離提取等。龔國立等通過造孔劑法并對多孔陶瓷進行改性成功制備出一種特殊硅藻土基多孔陶瓷，經檢測改性的硅藻土基多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵后，埃博霉素產量可達到65.7 mg/L，多孔陶瓷固定量量達0.042 g/g［42-43］。

4 展望

自20世紀90年代紫杉醇上市以來，它已經為數以千萬罹患癌癥的人們帶來了一線希望，其在臨床方面所取得的成就延福至今，但由于紫杉醇受到來源及耐藥性等諸多因素的限制，仍有許多不盡人意之處。而埃博霉素的問世可以說是彌補了紫杉醇絕大多數的缺點，其中最重要的便是相比于紫杉醇需要從植物中提取獲得，埃博霉素通過從微生物中提取就可獲得的這一天然優勢也決定了埃博霉素的生產成本將遠低于紫杉醇。盡管目前埃博霉素的產量仍有許多不盡人意之處，但隨著研究的不斷深入這一缺陷終將得到解決，屆時，埃博霉素必將以其高效且廉價的價格成為21世紀的抗癌先鋒之一。