基于瞬時表達系統的水稻miRNA靶基因快速驗證系統的建立

胡積祥 曹雅倩 朱秀梅 余超 田芳 楊鳳環 陳華民 何晨陽

（中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

microRNA（miRNA）普遍存在于真核生物細胞內，是一類長度為21-24 nt的非編碼RNA，通過剪切互補的靶基因mRNA或抑制靶基因的翻譯來行使其生物學功能［1-2］。miRNA不僅調控了植物的生長發育過程，而且在植物抗逆、抗病的過程中發揮著關鍵的作用，主要是通過調控相關內源基因的表達使植物對外界脅迫作出響應［3］。miR393通過下調生長素受體基因TIR1和AFB的表達阻斷生長素信號的傳導途徑，提高擬南芥對細菌性病害的抗性［4］。miR169通過調控靶基因NF-YA5（Nuclear factor YA5），在擬南芥抗旱中起著重要的作用［5］。隨著測序技術的飛速發展，大量新的miRNA被發現。目前 miRBase 22.1（http：//www.mirbase.org/）版本已經收錄了38 589個miRNA，然而大多數miRNA的生物學功能尚不明確。miRNA的功能解析，最關鍵的是鑒定出miRNA的靶基因。miRNA靶基因的鑒定 常 用 的 方 法 有 Northern blot［6］、Western Blot［7］、降 解 組 測 序（Degradome sequencing）［8］、MirTrap、RACE（Rapid amplication of cDNA ends）［9］和熒光素酶報告系統［10-11］。利用生物信息學預測miRNA靶基因，不同的方法和不同的參數條件都可能會得到不同的靶基因。因此，對預測的靶基因進行實驗驗證是必需的［12-13］。鑒于這一驗證過程的復雜性、耗時性，建立一種準確且快速地驗證miRNA靶基因的方法對研究miRNA的生物學功能具有非常重要的意義。基因的瞬時表達技術為miRNA靶基因的快速驗證提供了支撐。在植物中，目前大多數靶基因驗證的瞬時表達系統都是基于農桿菌介導的煙草瞬時表達體系，主要是將miRNA與帶有GFP（或YFP）的候選靶基因同時轉染到煙草葉片中，通過熒光強弱來驗證靶基因［10］。水稻是單子葉植物，運用煙草瞬時表達系統驗證水稻miRNA的靶基因不夠嚴謹，畢竟煙草細胞不同于水稻細胞。GFP發出熒光需要短波光的激發，而短波光對植物細胞有毒害作用。因此，在水稻原生質體內，利用化學發光的熒光素酶LUC來驗證水稻miRNA靶基因更具有優勢。

miR169是植物體內比較保守的一個大家族，miR169o可以被干旱脅迫誘導表達，而過表達miR169o則增強了植物對干旱的耐受性［14］。此外，過表達miR169o能促進水稻的生長，降低水稻對白葉枯病的抗病性［15］。前期通過qRT-PCR和5'RACE證明了靶基因LOC_Os03g48970.1（后文簡稱48970）受miR169o的抑制作用［16］。因此，本實驗以miR169o及其靶基因48970的對應關系為參照，系統研究了在農桿菌介導的煙草和PEG4000介導的水稻原生質體兩種瞬時表達體系下miRNA的動態變化，獲得了各自水稻靶基因驗證的最適體系，建立了水稻miRNA靶基因驗證的快速檢測系統，以期對水稻miRNA功能的解析提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

NEB限制性內切酶、T4 DNA連接酶；天根生物科技公司質粒提取試劑盒；Invitrogen公司TRIzol試劑；諾唯贊公司cDNA轉錄酶和實時定量PCR試劑盒；日本Yakult公司纖維素酶R-10和離析酶R-10；pUC19-nLUC，pCAMBIA1300載體，農桿菌GV3101，水稻日本晴，本氏煙均為實驗室所保存。大腸桿菌感受態為全式金Trans1-T1 Phage Resistant；抗生素及濃度：氨芐青霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，慶大霉素50 μg/mL；熒光活體成像儀為BERTHOLD TECHNOLOGIES LB 985 NightSHADE；Promega Luminometor熒光活性定量儀；ABI 7500 實時定量PCR儀。

所用引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 水稻原生質體的制備 采用酶解法制備原生質體［17］。日本晴種子于1/2 MS培養基（2.21 g/L MS，20 g/L Sugar，3‰植物凝膠）中28℃培養10 d-12 d，將幼苗莖部切成0.5 mm大小，立即放入有酶解液（0.6mol/L甘 露 醇，1.3% Cellulose，0.75% Macerozyme，20 mmol/L MES pH5.7，55℃加熱10 min，冷卻后加入 0.1% BSA，2 mmol/L CaCl2，5 mmol/L β-巰基乙醇，50 μg/mL羧芐，過濾除菌）的三角瓶中置于28℃，70 r/min的搖床中酶解6 h-8 h。35 μm尼龍篩網過濾酶解液，W5溶液（9.0 g/L NaCl，18.4 g/L CaCl2，0.37 g/L KCl，0.9 g/L Glucose，0.3 g/L MES，KOH 調 pH至5.7，滅菌）反復沖洗殘渣，離心（3 200 r/min，5 min）收集原生質體，棄上清。

表1 實驗所用引物

1.2.2 原生質體轉化 適量W5溶液重懸原生質體至濃度在（2-5）×106個細胞/mL，100 μL原生質中加入4 μg質粒，混勻后加入110 μL 40% PEG溶液（4 mL 配 方 ：1.6 g PEG，400 μL 1 mol/L CaCl2，1 333.3 μL 0.6 mol/L甘露醇，加滅菌水定容至4mL），混勻后室溫孵育15 min，加入1 mL W5，顛倒混勻，3 200 r/min，離心5 min，棄上清，再加入1 mL W5，3 200 r/min，離心5 min，棄上清，加入1 mL W5溶液，靜置培養。

1.2.3 原生質體總RNA的提取 參照Trizol說明書，稍作改進提取RNA，加入500 μL Trizol，劇烈震蕩，室溫放置2-3 min，加入200 μL氯仿，顛倒混勻，室溫放置5 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，轉移上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，最后用30 μL RNase-free的ddH2O溶解。

1.2.4 cDNA的反轉錄及實時熒光定量PCR 按諾唯贊公司的反轉錄試劑盒說明進行去基因組和反轉錄，反轉時加入0.5 μL 10 μmol/L的頸環引物。參照諾唯贊AceQ qPCR SYBR Green Master試劑盒進行qRT-PCR檢測。miR169o相對表達量按照2-ΔΔCt法計算，其中 ΔΔCt =（Ct樣品-CtU6）TimeX-（Ct對照樣品-CtU6）Time12，TimeX表示任意時間點，Ct為熒光閾值。

1.2.5 LUC活性的檢測 原生質體轉化后不同時間點取樣，取150 μL樣品，劇烈震蕩，加入至不透明96孔板中，加入0.75 μL LUC底物，利用Luminometer檢測LUC的相對活性。取500 μL樣品至24孔板中，加入2.5 μL LUC底物，利用CCD成像檢測熒光。

1.2.6 農桿菌介導的煙草瞬時表達［18］將pCAMBIA1300-miR169o，pCAMBIA1300-LUC，pCAMBIA1300-LUC-48970，pCAMBIA1300-LUC-48970m3等質粒分別導入到農桿菌GV3101，涂布在LB固體培養基上（卡那霉素 50 μg/mL+慶大霉素50 μg/mL），PCR驗證篩選陽性轉化子。煙草培養條件，每周期光照16 h，25℃，黑暗8 h，22℃，注射一個月左右的煙草。在注射前2 d，從平板上挑取單菌落搖菌，28℃過夜培養，然后按照1∶1 000的比例轉接到新的培養基中。5 000 r/min，22℃，離心5min收集菌體。用含有10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，150 μmol/L乙酰丁香酮，pH5.7的轉化緩沖液重懸菌體至終濃度為OD600=1.0，室溫靜置3 h后，按照各處理將兩種農桿菌按體積1∶1混合，注射煙草葉片。不同時間取樣，觀察LUC活性以及檢測miR169o的表達量。

2 結果

2.1 相關載體的構建

2.1.1 miR169o過表達載體的構建 PCR擴增得到444 bp的miR169o前體基因（MIR169o），經BamH I和PstI酶切后插入同樣酶切的pUC19-nLUC載體上，得到實驗所需的miR169o過表達載體pUC19-miR169o（ 圖 1-A）。pUC19-miR169o與 pCAMBIA-1300-nLUC分別用SacI和PstI消化后連接，將MIR-169o插入pCAMBIA1300載體中，得到pCAMBIA-1300-miR169o（圖 1-B）。

圖 1 pUC19-miR169o（A）和 pCAMBIA1300-miR169o（B）載體圖

圖2 pUC19-LUC（A）和pCAMBIA1300-LUC（B）載體圖

2.1.2 pUC19-LUC和pCAMBIA1300-LUC載體的構建 分別將pUC19-nLUC和pCAMBIA1300-nLUC載體中的nLUC片段替換為全長的LUC片段，同時引入SacI、SalI、PstI等酶切位點，分別得到適用于水稻原生質體系統和煙草瞬時表達系統的pUC19-LUC（圖2-A）和pCAMBIA1300-LUC載體（圖2-B）。

2.1.3 LUC-靶基因融合表達載體的構建 分別從 RGAP（Rice Genome Annotation Project） 和miRBase數據庫下載LOC_Os03g48970.1的CDS序列和miR169o的成熟序列。通過psRNA Target（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/） 分 析， 發現miR169o結合在48970的3' UTR區（堿基位置為1 237-1 256）。我們將這20個堿基的結合序列插入到LUC基因的3' UTR區（圖3-A），得到實驗所需的 pUC19-LUC-48970和 pCAMBIA1300-LUC-48970。miRNA與靶基因通過堿基互補配對方式結合，而結合的核心區域位于miRNA第9-11個堿基［19］。將CTA 3個堿基插入靶基因，插入位置正好對應于miRNA第10-11個堿基中間，使得miR169o無法剪切48970m3。將48970m3序列插入到LUC基因3' UTR中，得到對miR169o不敏感的48970m3表達載體（圖3-B），即pUC19-LUC-48970m3或pCAMBIA1300-LUC-48970m3。

圖3 LUC-48970（A）和LUC-48970m3（B）載體示意圖

2.2 水稻原生質體系統的靶基因驗證體系

將pUC19-miR169o分別與pUC19-LUC，pUC19-LUC-48970和pUC19-LUC-48970m3共轉化水稻原生質體。利用熒光活體成像儀和Luminometor檢測轉化12 h、18 h、24 h及36 h后LUC活性，發現在24 h時，熒光亮度最大。在3組組合中，pUC19-miR169o與pUC19-LUC-48970共轉化后，熒光活性最弱（圖4-A和4-B），表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的轉錄表達，而水稻原生質體系統可以用于水稻miRNA靶基因的檢測。此外，利用莖環qRT-PCR檢測了轉化后不同時間點miR169o的表達水平，在轉化后12-36 h之間miR169o的水平與表達時間具有正相關性，12 h表達量最低，而在36 h的表達量最高（圖4-C）。綜合熒光檢測效果和miR169o的表達水平，建議miRNA靶基因驗證的恰當檢測時間在水稻原生質體轉化后24-36 h之間。

2.3 煙草瞬時表達系統的靶基因驗證體系

將pCAMBIA1300-miR169o過表達載體、pCAMBIA1300-LUC-48970和pCAMBIA1300-LUC-48970m3融合載體，分別導入農桿菌中，共注射煙草葉片進行共表達。在注射煙草48 h、72 h和96 h后檢測LUC活性，發現在過表達72 h的熒光強度最高（圖5-A）；miR169o和48970共表達中的LUC活性明顯弱于miR169o和LUC，miR169o和48970m3共表達中的LUC活性，表明煙草瞬時表達系統可以用于水稻miRNA的靶基因驗證。此外，在24 h、48 h、72 h和96 h四個時間點分別取樣，以24 h LUC與miR169o共注射處理作為對照，以EF1為內參，通過莖環qRT-PCR檢測成熟miR169o的動態水平。結果表明注射農桿菌24-96 h后，成熟miR169o的表達水平逐漸增高，在48 h時，miR169o的表達水平已經提高到20倍左右（圖5-B）。因此，綜合熒光強度測定和成熟miR169o的水平，建議miRNA靶基因驗證的恰當檢測時間在煙草瞬時表達后48-72 h之間。

3 討論

在miRNA靶基因驗證實驗中，前人更多地關注靶基因的表達，而鮮有關注miRNA的動態表達。如Li等［20］共表達了artificial miRNA與其對應的靶基因，通過Western Blot分析靶基因編碼產物的表達差異；Martinho等［21］過表達了miRNA，檢測了轉錄水平上內源靶基因的差異性表達。而本研究測定了在共表達后不同時間點LUC活性和miRNA表達水平，從而可以動態反映miR169o對48970的特異調控過程。

無論是在水稻原生質體系統還是在煙草瞬時表達系統中，miR169o的表達水平總體上都會隨著時間的延長而呈現一定的上升。三種處理組合間miR169o的表達水平雖然存在著一定程度的差異，但都是在miR169o和LUC-48970組合中miR169o的表達水平較低，而其它兩種組合中miR169o水平相對較高。相較于其它組合，miR169o和LUC-48970組合中的LUC活性明顯降低，表明靶基因的轉錄被明顯地抑制。因此，本系統中miRNAs水平的差異對檢測結果并沒有造成影響，究其表達水平差異的具體原因則尚不明確。

隨著測序技術的發展，已經發現了大量的水稻miRNA在應對生物脅迫和非生物脅迫中發揮重要作用，而在解析這些miRNA調控機制的過程中最重要的內容是明確miRNA的靶基因及其功能。本文建立的靶基因驗證系統，可以為miRNA靶基因的篩選、驗證提供極大的便利條件，節省時間和實驗成本，為大批量的miRNA功能的解析提供技術支撐。當然，由于miRNA和LUC融合基因都處于動態的表達過程中，完全的均一化各處理中miRNA和LUC融合基因的轉化效率和表達量是比較困難的，因此，利用本系統進行篩選驗證，并結合其它靶基因驗證方法精確定位靶位點才是miRNA靶基因驗證的完美解決手段。

圖4 水稻原生質體表達系統中的靶基因驗證

圖5 煙草瞬時表達系統中miR169o的靶基因驗證

4 結論

本研究確立了適合水稻miRNA靶基因驗證的系統。在水稻原生質體轉化體系中，恰當的檢測時間點在轉化后24-36 h；在煙草瞬時表達體系中，恰當的檢測時間點在共注射后48-72 h。