黃芪對鉛損傷大鼠腦組織抗氧化能力影響的研究

尹曉婷，高偉超，李彥萱，張 珂，趙浩堂，周雅蕊，賴亞輝，孫維琦

（北華大學醫學院，吉林 吉林 132013）

鉛是一種高毒性重金屬，目前廣泛應用于現代工業生產。鉛被人體攝入后，以離子形式進入血液循環，通過血腦屏障進入腦[1]，臨床常見患者出現注意力障礙、記憶力喪失等癥狀[2]。鉛暴露對腦功能的影響還具有遠期效應，可以增加包括阿爾茲海默病在內的多種神經退行性疾病的發病率[3]。鉛損傷中樞神經系統的最主要機制究是氧化應激損傷[4]，然而黃芪的藥理學研究發現黃芪可以抗氧化改善學習記憶能力[5]。但關于黃芪抗鉛損傷的研究目前國內還鮮有研究，因此本實驗在建立大鼠鉛損傷的模型上進行不同濃度黃芪抗鉛損傷的研究，為臨床鉛損傷造成的學習記憶力障礙臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD雄性大鼠40只，大鼠體質量180～2 20 g，購于吉林大學醫學實驗動物中心，基礎飼料喂養，自由飲食、飲水。

1.1.2 藥品 黃芪顆粒黃芪顆粒（免煎型）由華潤三九醫藥股份有限公司提供，每包1 g，相當于生藥10 g，批號1103171S，GMP認證。

1.1.3 試劑及儀器 考馬斯亮藍法蛋白定量測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）測定試劑盒、膽堿酯酶（CHE）測試盒、谷胱甘肽過氧化無酶（GSH-Px）測試盒均購于南京建成生物工程研究所；醋酸鉛溶液1 g/L購于遼寧泉瑞試劑有限公司；TM-100 Morris水迷宮儀器（成都泰盟技術有限責任公司）；TAS-990AFG型原子吸收分光光度計（普析通用）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將40只SD大鼠隨機分成5組，每組8只。分別為正常對照組、鉛損傷模型組、鉛損傷黃芪顆粒高、中、低劑量組。正常對照組大鼠自由據結果以均數±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪顆粒對鉛損傷大鼠學習記憶能力的影響 定位航行實驗中，鉛損傷模型組大鼠的平均逃避潛伏期、飲用蒸餾水；鉛損傷模型組、鉛損傷黃芪高、中、低劑量組自由飲用濃度為1 g/L的醋酸鉛溶液共4周，鉛損傷黃芪顆粒干預組按 3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg 劑量，加入蒸餾水制備混懸液灌胃；正常對照組、鉛損傷模型組灌胃等容量生理鹽水。每6 d稱1次體質量，調整灌胃量，1次/d，連續4周。

1.2.2 Morris水迷宮測試 時間為7 d （每日上午8：30—12：00）。該實驗分為兩部分，1）定位航行實驗：將小鼠置于水迷宮的房間適應0.5 h，每只小鼠每天均訓練1次，在平臺的對面，面向池壁將小鼠放入水中，記錄小鼠的逃避潛伏期；在120 s內還未找到平臺，并記錄逃避潛伏期為60 s。最后都讓小鼠在平臺停留15 s。2）空間探索實驗：訓練第6天將平臺撤出，入水點不變，把小鼠放入水中120 s，測量目標象限滯留時間、游泳路程及速度。

1.2.3 大鼠標本處理 用嚙齒動物專用斷頭器斷頭處死大鼠，取大腦制成10%的腦組織勻漿，在溫度4℃下，3500 r/min離心15 min，收集上清液待測。同時完成取右側股骨操作，將股骨上肉剔除干凈后剪成碎段放入帶有編號的小燒杯中備用。

1.2.4 指標檢測 按照試劑盒步驟檢測大鼠腦中膽堿酯酶（CHE）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）含量。 蛋白定量采用考馬斯亮藍法。原子吸收石墨爐法檢測骨鉛含量。

1.3 統計學方法 通過SPSS 22.0軟件進行統計，數運動距離長于正常組（P＜0.05），鉛損傷模型組與黃芪顆粒劑量組大鼠的平均逃避潛伏期、運動距離對比，隨黃芪劑量增加而縮短（P＜0.05）；在空間探索實驗中，鉛損模型組大鼠的滯留時間和穿越次數均少于正常組（P＜0.05），鉛損傷模型組與黃芪劑量組大鼠的滯留時間和穿越次數隨黃芪劑量增加而逐漸增多（P＜0.05）。結果見表1。

2.2 黃芪顆粒對鉛損傷大鼠腦組織中抗氧化能力的影響 模型組的MDA含量高于正常對照組MDA含量，差異有統計學意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預組與模型組對比MDA明顯降低，并隨劑量增加而明顯降低，有統計學意義（P＜0.05）；模型組的SOD水平低于正常對照組SOD水平，模型組與正常對照組之間差異有統計學意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預組與模型組對比SOD明顯增高，并隨劑量增加而明顯增加，有統計學意義（P＜0.05）；模型組的CHE活力低于正常對照組CHE水平，造模組與正常對照組之間差異有統計學意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預組與模型組對比CHE明顯增高，并隨劑量增加而明顯增加，有統計學意義（P＜0.05）；正常對照組和模型組大鼠腦組織中GSH-Px相較，模型組明顯降低有統計學意義（P＜0.05），造模組和黃芪顆粒低、中、高干預組對比沒有統計學意義（P＞0.05）；模型組NO含量高于其它4組NO含量，差異有統計學意義（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預組與模型組對比NO明顯降低，并隨劑量增加而明顯降低，有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

表1 黃芪對鉛損傷大鼠空間學習記憶能力的影響（±s， n = 8）

表1 黃芪對鉛損傷大鼠空間學習記憶能力的影響（±s， n = 8）

注：與正常對照組比較，# P＜0.05；與低劑量黃芪組比較，△P＜0.05；與中劑量黃芪組比較，▲P＜0.05；與高劑量黃芪組比較，□P＜0.05

組 別 定位航行實驗 空間探索實驗潛伏期/s 運動距離/m 滯留時間/s 穿越次數/次正常對照組 30.427±4.669 8.717±2.320 16.800±4.201 13.500±3.338黃芪低劑量組 39.721±4.520 11.465±5.240 10.871±2.621 11.714±3.251黃芪中劑量組 37.300±3.323 11.980±4.176 13.671±3.992 11.857±3.132黃芪高劑量組 34.725±6.091 9.361±2.019 16.713±3.392 13.875±1.885鉛損傷模型組 42.585±4.632#△▲□ 11.980±4.299#△▲□ 11.756±3.740#△▲□ 7.889±3.444#△▲□

表2 黃芪對鉛損傷大鼠大腦中MDA、SOD、CHE、GSH-Px、NO的影響（±s， n = 8）

表2 黃芪對鉛損傷大鼠大腦中MDA、SOD、CHE、GSH-Px、NO的影響（±s， n = 8）

注：與正常對照組比較，# P＜0.05；與低劑量黃芪組比較，△P＜0.05；與中劑量黃芪組比較，▲P＜0.05；與高劑量黃芪組比較，□P＜0.05

組 別 MDA/（nmol/mg） SOD/（U/mg） CHE/（U/mg） GSH-Px/（μmol/L） NO/（μmol/g）正常對照組 0.265±0.127 13.699±2.995 5.716±2.506 5.121±1.785 0.886±0.789黃芪劑量組 0.550±0.294 11.351±1.133 5.471±1.328 3.919±1.008 1.223±0.481黃芪中劑量組 0.421±0.381 11.277±2.045 4.323±1.192 3.571±1.722 1.065±0.642黃芪高劑量組 0.370±0.134 10.994±1.519 4.638±1.188 3.885±1.199 0.991±0.714鉛損傷模型組 0.665±0.395#△▲□ 10.609±2.069#△▲□ 5.630±3.088#△▲□ 3.656±0.704#△▲□ 2.135±1.014#△▲□

2.3 黃芪對鉛損傷大鼠骨鉛檢測結果 鉛損傷模型組的骨鉛含量顯著高于正常對照組（P＜0.05），低、中、高劑量黃芪顆粒干預組與模型組對比骨鉛含量明顯下降，并隨劑量增加而明顯降低，有統計學意義（P＜0.05）。結果見表3。

3 小結

黃芪是一味具有補氣益氣功效的中藥，《神農本草經》中記載：“黃芪，味甘，性微溫，歸肺、脾、肝、腎經?！敝嗅t認為，黃芪具有補虛補陽、疏肝解郁、利尿消腫之功效。現代藥理學證明黃芪主要化學成分是黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類、氨基酸、微量元素等，具有增強免疫系統功能、調節血壓、抗腫瘤、抗衰老等作用[6]。鉛是日常生活中常見的重金屬污染物,主要通過飲食攝入、皮膚接觸和氣體交換三個途徑進入機體并蓄積，繼而在機體中產生毒性損傷。中樞神經系統是機體鉛損傷最為敏感的主要靶器官之一，同樣也是受損最為嚴重的系統，損傷中樞神經系統后臨床常見頑固性頭痛、精神遲鈍和注意力障礙、記憶力喪失等癥狀，兒童較成人更容易被損傷，臨床癥狀更加明顯[7]。

表3 各組大鼠骨鉛水平測定結果（±s ，n = 8）

表3 各組大鼠骨鉛水平測定結果（±s ，n = 8）

注：與正常對照組比較，# P＜0.05；與低劑量黃芪組比較，△P＜0.05；與中劑量黃芪組比較，▲P＜0.05；與高劑量黃芪組比較，□P＜0.05

組 別 骨鉛含量/（μg/g）正常對照組 13.469±4.029低劑量組 29.960±4.503中劑量組 24.267±6.155高劑量組 23.792±8.062鉛損傷模型組 42.116±12.389#△▲□

學習記憶障礙作為鉛損傷損傷后的常見的臨床癥狀，被醫學界廣泛研究與重視，Morris水迷宮是一種通過強迫實驗動物游泳來學習尋找隱藏于水中的平臺的操作過程, 是目前世界公認的較客觀的評價學習記憶功能方法[8]。本實驗研究表明鉛損傷大鼠在黃芪顆粒的干預下定位航行和空間探索有明顯的改善，提高了大鼠的學習記憶能力。本研究還發現黃芪顆粒有促進鉛在機體內代謝的作用，大鼠體內的骨鉛在黃芪顆粒干預下可明顯降低。

鉛在大腦中的氧化應激損傷途徑主要包括兩個方面，一是使腦中氧自由基產量增多，另一個就是影響腦中的抗氧化過程[9]。抗氧化應激包括酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統兩大方面。SOD、CHE、GSH-Px是機體內清除氧自由基的重要酶類，能夠使超氧化物陰離子轉變為HO和氧分子，從而保護細胞膜，防止細胞破壞。鉛損傷大鼠大腦時引起SOD、CHE、GSHPx活性下降，大量氧自由基產生，導致腦組織損傷。本實驗結果也證實鉛損傷模型組SOD、CHE、GSH-Px活性明顯下降，鉛損傷下腦組織清除氧自由基的能力下降；通過黃芪顆粒干預后SOD、CHE活性明顯升高，表明黃芪顆粒能夠提高SOD、CHE的活性，清除氧自由基，但對GSH-Px活性影響不明顯。MDA是脂質過氧化物的終產物，它能夠使細胞突變、衰老、死亡、生物膜變性或壞死。因此，檢測MDA含量能夠間接反應細胞損傷的程度。本實驗結果表明鉛損傷模型組MDA含量明顯增加，經黃芪顆粒干預后MDA含量明顯下降，提示黃芪顆粒能夠抑制脂質過氧化反應，保護腦組織。鉛蓄積影響一氧化氮合酶（NOS）的活力，催化產生NO，激發誘導細胞氧化應激損傷，引發神經細胞凋亡，影響學習記憶功能[10]，吳立蓉等通過研究黃芪對Ⅱ型糖尿病大鼠抗氧化能力的影響發現，黃芪可以增強糖尿病大鼠的抗氧化作用并抑制糖尿病大鼠血清NO/NOS水平[11]，本實驗結果表明鉛損傷模型組NO含量明顯增加，經黃芪顆粒干預后NO含量明顯下降，黃芪拮抗了鉛損傷造成的腦內NO增高造成的氧化應激，提高學習記憶能力。大量的研究發現黃芪在抗氧化應激方面有多方面積極效應，黃芪可以減輕自由基對腦細胞DNA的損傷，維護海馬區神經細胞的結構完整性，改善或延遲腦組織和神經元退行性變[12]，還可以通過減少Ros（reactive oxygen species）的釋放和激活抗氧化劑元素[13]，抑制氧化應激介導的凋亡[14]，恢復線粒體功能障礙和氧化應激引起的形態學改變[15]。

綜上所述，黃芪顆粒對鉛損傷后大鼠腦組織中抗氧化作用有顯著影響，能明顯提高鉛損傷后大鼠學習記憶能力，其機制可能是通過拮抗腦內氧化應激，具體拮抗途徑還有待于研究。雖然黃芪抗氧化作用的研究很多，但針對于黃芪拮抗鉛損傷的基礎實驗較少，希望本實驗能為黃芪拮抗鉛損傷作用提供有用的實驗依據。