氣相色譜-質譜/質譜法測定大米中環酰菌胺和啶酰菌胺殘留量

遲 迅，趙韞慧，劉 洋，修 洋，宋清蓮，顧婷婷，楊 璐，胡婷婷*，于海俠

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.長春海關技術中心，長春 130062；3.長春市抗癌藥物研究所，長春 130000）

啶酰菌胺（boscalid）、環酰菌胺（fenhexamid）是兩種殺菌劑，主要對防核病、灰霉病和各種腐爛病等病害有非常好的治菌效果。環酰菌胺和啶酰菌胺還對其他藥劑的抗性菌有良好的效果，其中包括蔬菜、大田作物和果樹等病害的防治，是新型酰胺類內吸性殺菌劑。新型酰胺類內吸性殺菌劑由于其特有的作用機理[1-3]，與環境相容性良好，對作物安全不，加之易產生交互抗性，因此應用前景十分廣闊。國內尚沒有這兩種殺菌劑應用于大米的檢測標準和相關研究。

盡管新型酰胺類殺菌劑（如環酰菌胺和啶酰菌胺）屬于低毒類農藥，但由于使用量和使用范圍不斷提高和擴大，其環境生態、作物殘留等問題引起了廣泛的關注[4]。為此，世界各國對食品中新型酰胺類殺菌劑的最大殘留量均有著嚴格的規定。因此，建立啶酰菌胺、環酰菌胺殺菌劑的檢測方法對規范其合理使用將起到重要的作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器 Agilent 7890A-7000B氣相色譜-質/質譜A（美國Agilent 公司）；Milli-Q高純水發生器（美國Millipore公司）；Sigma 3-30K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；T25 高速分散機（德國IKA公司）；XP205分析天平：感量0.01 mg（瑞士Mettler公司）。

1.2 試劑 環酰菌胺和啶酰菌胺標準物質對照品：環酰菌胺標準物質（Fenhexamid，CAS號：126833-17-8，分子式：C14H17Cl2NO2）：純度大于等于98.0%；啶酰菌胺標準物質（Boscalid，CAS號：188425-85-6，分子式：C18H12Cl2N2O）：純度大于等于98.0%。C18固相吸附劑：粒徑40～60 μm；乙二胺-N-丙基硅烷 （PSA） 吸附劑：粒徑40～60 μm；無水硫酸鎂：550 ℃灼燒4 h，在干燥器內冷卻至室溫，貯于密封瓶中備用；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司，批號：13010236）；丙酮（色譜純，美國TEDIA公司，批號：18040118）；水為去離子水。

1.3 標準溶液的配制 分別準確稱取按其純度折算為100%質量的環酰菌胺和啶酰菌胺各50.0 mg，分別用丙酮溶解并定容至100 mL，濃度相當于500 mg/L，儲備液在- 18℃避光保存。根據需要，用環酰菌胺和啶酰菌胺標準儲備溶液配制成1.0 μg/mL混合標準工作溶液。吸取適量的上述混合標準溶液0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mL，用丙酮定容至1 mL，配制成混合標準工作溶液，現用現配。

1.4 樣品前處理 稱取大米粉樣品2.0 g（精確到0.01 g），加入50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙腈溶液、1.0 g氯化鈉、4.0 g無水硫酸鎂，高速均質1 min，10000 r/min離心5 min。吸取5 mL提取液于15.0 mL具塞離心管中，待凈化；準確吸取提取液于預先加有250 mg C18、250 mg PSA吸附劑的離心管中，渦旋1 min，以4000 r/min離心5 min，靜置10 min，準確吸取1.0 mL上清液，水浴45 ℃氮氣吹至近干，丙酮定容至1.0 mL，0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS/MS分析。

1.5 氣相條件-質譜/質譜條件 1）色譜柱：HP-5 MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；2）進樣口溫度：260 ℃；3）載氣為99.999% He氣，恒流模式，流速為1.0 mL/min；4）離子源溫度：280 ℃；5）電離能量：70 eV；6）柱溫：100 ℃；7）程序升溫：60℃保持1 min，以15 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min；8）接口（傳輸線）溫度：280 ℃，；9）電子轟擊電離源（EI）：選擇反應監測模式（SRM），選擇離子監測條件見表1；10）溶劑延遲時間：5 min；11）進樣量：1.0 mL；12）進樣方式：不分流。

表1 選擇監測離子及碰撞能量

2 結果與討論

2.1 QuEChERS方法鹽析劑和吸水劑選擇 對環酰菌胺和啶酰菌胺進行考察，考察無水硫酸鎂和無水硫酸鈉兩種吸水劑，及氯化鈉和乙酸鈉兩種鹽析劑對農藥提取效果的影響。使用氯化鈉和乙酸鈉作為鹽析劑時，其添加農藥的平均回收率相差在3. 0%以內，對回收率沒的影響并不顯著。吸水劑的比較結果顯示：使用無水硫酸鎂的回收率要優于無水硫酸鈉，回收率提高了5. 9%～11. 7%。原因在于凈化步驟中使用的PSA屬于正相吸附劑，樣品含水量越少凈化效果越好，無水硫酸鎂的吸水能力強且在吸水過程中放熱，有利于農藥的提取；而且無水硫酸鎂粒度較小，在振搖和渦旋過程中與樣品的混合更加充分，并能夠與乙腈發生協同作用從而提高提取效率。

2.2 凈化條件的選擇 QuEChERS方法已成為分散固相萃取的“模板（template）”方法，可根據分析物的物化性質、基質的種類及測定需求而選擇不同的分散吸附劑，常用吸附劑乙二胺N-丙基硅烷（PSA）可保留酸性農藥，同時取出油脂和色素[11]。C18可通過非極性相互作用去除提取液中弱極性甾族類基質干擾物，部分去除脂肪酸及烯烴類基質干擾物[12]。因此本文方法選用C18和吸附劑乙二胺N-丙基硅烷（PSA）為分散吸附劑。

分別對比不同PSA、C18 配比對大米中環酰菌胺和啶酰菌胺平均回收率的影響，取2.0 g樣品，對本底不含環酰菌胺和啶酰菌胺的樣品，添加0.01 mg/kg 混合標準工作液，經10 mL乙腈提取鹽析離心后，分取5 mL提取液分別加入用C18和PSA吸附劑凈化，分取1 mL凈化液經0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS/MS測定，平均6次結果顯示如圖1-3所示，C18 和PSA吸附劑用量分別為每毫升提取液加50 mg時凈化效果最佳，加大用量不能提高凈化效果，因此本文采用C18和PSA吸附劑用量分別為每毫升提取液加50 mg進行d-SPE凈化。1）C18100 mg+PSA 100 mg 、2）C18100 mg+PSA 250 mg和3）C18100 mg+PSA 500 mg 對比如圖1所示；4）C18250 mg+PSA 100 mg、5）C18250 mg+PSA 250 mg 和 6）C18250 mg+PSA 500 mg對比如圖2所示；7）C18500 mg +PSA 100 mg、8）C18500 mg + PSA250 mg和9）C18500 mg + PSA 500 mg對比如圖3所示。

圖1 環酰菌胺和啶酰菌胺不同用量分散固相萃取凈化后的平均回收率對比圖

2.3 氣相條件-質譜/質譜條件 Agilent HP-5 MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：260 ℃；載氣為99.999% He氣，恒流模式，流速為1.0 mL/min；離子源溫度：280 ℃；電離能量：70 eV；柱溫：70 ℃。程序升溫見表2；接口（傳輸線）溫度：280 ℃，；電子轟擊電離源（EI），選擇反應監測模式（SRM），選擇離子監測條件見表3；溶劑延遲時間：5 min；進樣量：1.0 mL；進樣方式：不分流。

圖2 環酰菌胺和啶酰菌胺不同用量分散固相萃取凈化后的平均回收率對比圖

圖3 環酰菌胺和啶酰菌胺不同用量分散固相萃取凈化后的平均回收率對比圖

表2 氣相色譜-質譜/質譜方法程序升溫

表3 選擇監測離子及碰撞能量

2.4 質譜條件的選擇的優化 使用的氣相色譜質譜/質譜儀中的離子源為電子轟擊（EI）離子源，并采用三重四極桿質量分析器進行選擇反應監測掃描，可快速的對復雜混合物進行痕量分析，從而有效提高方法的靈敏度和選擇性。以啶酰菌胺為例，先進行Q1全掃描，質譜圖見圖4，選擇豐度高，質荷比大的111.81和139.80作為特征離子，通過Q2進行誘導碰撞，通過Q3掃描得到一系列碎片離子圖，選擇選擇豐度高碎片離子用來定量，另一個用來輔助定性，從而建立經典的選擇反應監測掃描。環酰菌胺Q1全掃描特征離子，見圖5；啶酰菌胺和環酰菌胺選擇離子監測色譜圖，見圖6。

2.5 方法的測定低限與線性關系 配制啶酰菌胺和環酰菌胺農藥混標溶液，稀釋成一定梯度的濃度。在最佳的色譜條件和質譜條件下進行測定，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析、線性范圍均在0.01～0.20 mg/kg。逐步稀釋混合標準溶液，以信噪比大于10（S/N≥10）作為測定低限均在0.01 mg/kg。線性方程、相關系數見表4；曲線如下圖7和8所示。

2.6 回收率與精密度 采用添加法，即對本底不含待測環酰菌胺和啶酰菌胺的大米分別添加濃度為0.01、0.02、0.10 mg/kg水平的樣品進行回收測定，每水平單獨測定10次。啶酰菌胺回收率范圍為70.3%～86.5%，相對標準偏差為5.98～8.51；環酰菌胺回收率范圍為71.0%～89.0%，相對標準偏差為4.71～8.24；實驗室內部方法的精密度和精確度符合農藥殘留的檢測要求。回收率結果如表5所示；空白樣品及空白樣品加標圖如下圖9、10、11所示。

圖4 啶酰菌胺Q1全掃描特征離子圖

圖5 環酰菌胺Q1全掃描特征離子圖

圖6 啶酰菌胺和環酰菌胺選擇離子監測色譜圖

表4 啶酰菌胺和環酰菌胺農藥的相關系數和線性方程

圖7 啶酰菌胺標準溶液線性關系圖

圖8 環酰菌胺標準溶液線性關系圖

2.7 研究的覆蓋性和代表性 應用本方法對市售的25個大米樣品進行檢測，結果有一個大米樣品有陽性檢出，含量為0.1 mg/kg，證明本方法準確可靠，能夠起 到為市場把關的作用。

圖9 大米空白樣品的選擇離子檢測色譜圖

圖10 大米空白樣品加標（0.01 mg/kg）選擇離子檢測色譜圖

圖11 大米空白樣品加標（0.02 mg/kg）選擇離子檢測色譜圖

表5 大米中環酰菌胺和啶酰菌胺添加水平及其回收率（n = 10）

3 結論

本文建立了應用無水硫酸鎂、PSA吸附劑和C18固相吸附劑分散固相萃取凈化，經氣相色譜-質譜/質譜檢測和確證，測定大米中環酰菌胺和啶酰菌胺藥物殘留量的方法。該方法具有選擇性好、靈敏度高、回收率高、精密度好、操作簡便等特點，適用于大米中環酰菌胺和啶酰菌胺藥物殘留量的測定。為確保大米安全作出了貢獻，促進我國農業健康發展，保障食品安全，具有重要的社會意義。