促紅細(xì)胞生成素對新生大鼠高膽紅素血癥的腦保護(hù)作用

祝 巍，元熙哲， 孫智勇，張煒煜,3，高 燕

（1.吉林省婦幼保健院新生兒科，長春 130000；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 延邊 133000；3.吉林省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗所，長春 130000）

新生兒高膽紅素血癥當(dāng)前在新生兒中的發(fā)病率比較高，在臨床上主要表現(xiàn)為黃疸等癥狀，主要是由于胎兒肝臟清除膽紅素功能不成熟而引起，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致不可逆腦損傷的發(fā)生[1]。特別是過量的游離膽紅素可通過血-腦脊液屏障引起腦能量的代謝障礙，誘發(fā)興奮性氨基酸持續(xù)表達(dá)上升，也可產(chǎn)生活性異常的Na+-K+-ATP 酶，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞膜的功能被損壞，繼而導(dǎo)致腦水腫[2-4]。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin, EPO）是一種糖蛋白激素，也為一種可作用于骨髓造血細(xì)胞，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生、分化，最終成熟的內(nèi)分泌激素[5-7]。現(xiàn)代研究表明，EPO是一種新型的神經(jīng)保護(hù)藥物，具有顯著的營養(yǎng)神經(jīng)及神經(jīng)保護(hù)作用的功能，并且其還具有抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗炎，營養(yǎng)神經(jīng)活性，可提高腦組織對缺血缺氧的耐受能力等多種作用[5-6]。本研究通過建立新生大鼠高膽紅素血癥模型，探討EPO對新生大鼠高膽紅素血癥的腦保護(hù)作用，以為高膽紅素血癥的診治及用藥提供一定的理論依據(jù)。現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選擇7 d齡清潔級SD 雄性新生大鼠共60只，體質(zhì)量（15.02±1.53）g，由吉林省婦幼保健院實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 晶體膽紅素、鼠神經(jīng)生長因子制劑購自美國sigma公司，EPO購自上海生工公司，IL-6、SOD、MDA、TNF-α等檢測試劑盒購自北京華英生物技術(shù)。

1.3 實驗儀器 電子分析天平儀、全自動組織脫水機(jī)、低溫高速離心機(jī)器、電熱恒溫干燥箱等均由本實驗室提供。

1.4 動物分組與處理 所有大鼠隨機(jī)分成3組：模型組、對照組與EPO組，每組各20只。

所有大鼠都建立了高膽紅素血癥模型，模型制作參照文獻(xiàn)[7]的制備方法，劑量為50 μg/g 的膽紅素溶液被腹腔注射于新生兒大鼠中，常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)。對照組在模型建立后即刻給予腹腔注射鼠神經(jīng)生長因子，劑量為50 μg/kg·d，1次/d，共3 d。EPO組在對照組治療的基礎(chǔ)上經(jīng)頸靜脈注射EPO（300 U/kg），1次/d，共3 d。模型組注射同劑量的PBS，1次/d，共3 d。

1.5 觀察指標(biāo) 1）觀察大鼠的一般行為學(xué)狀況。2）所有大鼠在治療后1 d、治療后2 d與治療后3 d進(jìn)行按照Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分：0分為無可察覺的后肢活動；1分為可察覺的微弱后肢活動，但無法對抗重力；2分為后肢能對抗重力但無法站立；3分為可正常站立、行走，但不能正常跳躍；4分為后肢功能完全恢復(fù)，能正常跳躍。3）取處死大鼠的靜脈血樣本，離心后取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測組織中的IL-6和TNF-α的表達(dá)情況，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 選擇SPSS 20.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，對比為t檢驗；計數(shù)資料采用百分比（%）表示，對比采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α = 0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)狀況 3組大鼠在模型建立前都呼吸平穩(wěn)，對外界刺激反應(yīng)靈敏，無翻滾、俯伏、煩躁等行為學(xué)表現(xiàn)；建模后大鼠皮膚黃染逐漸加重，模型組大鼠出現(xiàn)翻滾、俯伏與對外界刺激反應(yīng)遲鈍等癥狀，對照組大鼠的行為學(xué)異常表現(xiàn)顯著輕于模型組，而EPO組的大鼠的行為學(xué)異常輕于對照組，無煩躁、翻滾伏等行為學(xué)表現(xiàn)，對外界刺激反應(yīng)靈敏。

2.23 組大鼠不同時間點的神經(jīng)行為學(xué)評分對比 見表1。

表13組大鼠不同時間點的神經(jīng)行為學(xué)評分對比（±s ，n = 20） 分

注：與對照組對比，# P＜0.05；與模型組對比，△P＜0.05

組 別 治療后1 d 治療后2 d 治療后3 d EPO組 3.44±0.24#△ 3.56±0.43#△ 3.50±0.51#△對照組 2.54±0.22△ 2.58±0.41△ 2.58±0.88△模型組 1.34±0.29 1.28±0.25 1.29±0.34

2.33 組術(shù)后3 d海馬組織的SOD、MDA含量對比 見表2。

表23組術(shù)后3 d海馬組織的SOD、MDA含量對比（±s ，n = 20） μmol/L

表23組術(shù)后3 d海馬組織的SOD、MDA含量對比（±s ，n = 20） μmol/L

注：與對照組對比，# P＜0.05；與模型組對比，△P＜0.05

組 別 SOD MDA EPO組 156.40±14.63#△ 0.78±0.21#△對照組 122.87±12.74△ 2.09±0.51△模型組 66.30±10.92 4.98±0.81

2.43 組術(shù)后3 d的血清炎癥因子表達(dá)對比 見表3。

表33組術(shù)后3 d的血清炎癥因子表達(dá)對比（±s ，n = 20） ng/mL

表33組術(shù)后3 d的血清炎癥因子表達(dá)對比（±s ，n = 20） ng/mL

注：與對照組對比，# P＜0.05；與模型組對比，△P＜0.05

組 別 IL-6 TNF-α EPO組 3.98±1.05#△ 2.76±0.78#△對照組 7.34±2.13△ 6.49±1.68△模型組 13.67±3.89 11.76±3.22

3 討論

高膽紅素血癥約出現(xiàn)在70%的新生兒中，早期癥狀不明顯，但是隨著病情的進(jìn)展，可發(fā)展為膽紅素腦病，誘發(fā)患兒出現(xiàn)智力障礙，造成腦損傷[8-10]。由于膽紅素腦病早期臨床特異性表現(xiàn)缺乏，在治療上可存在滯后性，為此早期進(jìn)行治療能發(fā)揮有效的腦保護(hù)作用。SD大鼠是屬于生后發(fā)育型，7 d的SD大鼠其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相對成熟度類似胎兒或新生兒，也可反映新生兒的發(fā)育狀況，當(dāng)前在基礎(chǔ)研究中比較常見[11]。

鼠神經(jīng)生長因子是一種有效的腦保護(hù)劑，能夠通過多種途徑來減輕有害因素對腦組織的損害，保護(hù)神經(jīng)元。EPO是一種多功能營養(yǎng)因子及神經(jīng)保護(hù)因子，能通過激活背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上鈣通道，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度發(fā)揮其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[12-14]。EPO也可阻止缺氧和興奮性神經(jīng)毒物谷氨酸所介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，可減輕缺氧、谷氨酸等氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞的損傷[15]。本研究顯示EPO組與對照組治療后1 d、治療后2 d與治療后3 d的Tarlov評分高于模型組（P＜0.05），EPO組也高于對照組（P＜0.05），表明EPO的應(yīng)用能發(fā)揮腦保護(hù)作用，促進(jìn)大鼠神經(jīng)行為功能的恢復(fù)。

新生大鼠高膽紅素血癥的發(fā)生機(jī)制還不明確，但是可導(dǎo)致腦損傷，且目前臨床上暫無有效的治療藥物，也不利于新生兒的預(yù)后改善[16]。常規(guī)研究認(rèn)為高膽紅素血癥的發(fā)生與發(fā)展涉及到炎癥因子與趨化因子的表達(dá)變化調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)外離子情況變化、腦組織局部脂質(zhì)的過氧化以及自由基的產(chǎn)生等[17]。特別是海馬組織膜結(jié)構(gòu)含有豐富的脂質(zhì)，可產(chǎn)生大量氧自由基，高膽紅素血癥可使神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化還原酶系脫耦聯(lián)，導(dǎo)致神經(jīng)元的繼發(fā)性損害[18]。本研究顯示治療后3 d，EPO組海馬組織的SOD含量高于對照組與模型組（P＜0.05），MDA含量低于對照組與模型組（P＜0.05），對照組與模型組對比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從機(jī)制上分析，EPO具有拮抗谷氨酸鹽對神經(jīng)細(xì)胞的興奮性毒性反應(yīng)，可使紅細(xì)胞內(nèi)降低的抗氧化損害的酶恢復(fù)至正常水平而發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用；并且EPO能有效增加SOD活性，減少再腦損傷后MDA含量，抑制中性粒細(xì)胞活性，從而更加有效發(fā)揮減少活性氧的生成、減輕線粒體超載的作用。

在高膽紅素血癥的發(fā)病過程中，可表現(xiàn)為胞內(nèi)NF-kB途徑的激活，促使IL-6、TNF-α的釋放。當(dāng)前研究表明IL-6、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生和釋放是外界刺激信號經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路向細(xì)胞核介導(dǎo)的結(jié)果，抑制炎癥因子的釋放可避免組織器官在結(jié)構(gòu)和功能上進(jìn)一步的損害，實現(xiàn)了對器官損傷的防治作用[19]。本研究顯示治療后3 d ，EPO組的IL-6和TNF-α值低于對照組與模型組（P＜0.05），對照組低于模型組（P＜0.05）。從機(jī)制上分析，EPO可抑制炎癥反應(yīng)，增加腦血流量，減輕水腫，抑制血管活性，穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜；并且其也能減輕組織水腫、減少組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，抑制炎癥因子的釋放，從而增強(qiáng)機(jī)體對高膽紅素血癥的耐受能力[20]。同時EPO也可以促進(jìn)腦損傷局部神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)，有效動員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腦損傷部位聚集，加快腦損傷的恢復(fù)[21]。本研究也有一定的不足，體內(nèi)模型與臨床治療畢竟還存在很大的差距，且納入的大鼠數(shù)量較少，沒有進(jìn)行劑量分析，導(dǎo)致可能存在研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。