乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中EZH2、VEGF和MVD的表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系＊

徐憲偉，徐小艷，王 娜，王 慧，門(mén)穎麗，李 川，楊金花

乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（invasive ductal carcinoma）又稱(chēng)為非特殊類(lèi)型浸潤(rùn)性癌，是乳腺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型之一。 EZH2基因 （enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類(lèi)同源物，是PcG（Polycomb Group）基因家族的重要成員之一。EZH2能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)。目前，EZH2在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及作用研究有限，尚未見(jiàn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌EZH2與血管生成之間關(guān)系的研究。該研究擬采用免疫組化SP法檢測(cè)EZH2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD34蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)，旨在探討與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集鄭州人民醫(yī)院2013年1月—2014年12月期間的病理活檢標(biāo)本130例，包括正常乳腺組織15例，乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌10例，高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌15例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌原發(fā)灶90例。90例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者術(shù)前均未接受放療或化療，同時(shí)收集患者相關(guān)臨床資料。按照2012年WHO乳腺癌組織病理分級(jí)分類(lèi)法，對(duì)其進(jìn)行分組。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的甲醛固定，石蠟包埋，并經(jīng)鄭州人民醫(yī)院病理科診斷確診。

1.2 主要試劑EZH2、VEGF和CD34一抗兔抗人單克隆抗體（即用型）、二抗及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均采購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色（1）石蠟切片（3 μm）經(jīng)烤片、脫蠟并水化；（2）抗原修復(fù)；（3）一抗 37℃孵育2 h；（4） 二抗室溫孵育 30 min；（5）DAB 顯色 5 min；用于定性觀察和拍照的切片對(duì)比染色，用于定量測(cè)試的切片不對(duì)比染色；脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。用已知EZH2、VEGF和CD34陽(yáng)性的乳腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽(yáng)性和空白對(duì)照。

1.4 EZH2和VEGF免疫組化定量測(cè)試根據(jù)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和乳腺癌組織自身陰性對(duì)照的顯色情況，在確定無(wú)假陽(yáng)性和假陰性的前提下，以EZH2細(xì)胞核染成棕黃色，VEGF細(xì)胞質(zhì)染成棕褐色為陽(yáng)性。用ImagePro Plus圖像分析軟件，測(cè)試各例樣本的陽(yáng)性單位值（Positive Unit，PU）［1，2］。具體方法如下：用ImagePro Plus圖像分析軟件在40倍物鏡下，從每例切片中取10個(gè)著色最強(qiáng)的視野輸入計(jì)算機(jī)，把其轉(zhuǎn)換成灰色照片。對(duì)于正常乳腺組織，每個(gè)視野測(cè)試20個(gè)正常乳腺上皮細(xì)胞 （數(shù)目不足者，測(cè)完整張切片為止）；對(duì)于乳腺導(dǎo)管癌組織，每個(gè)視野測(cè)試20個(gè)陽(yáng)性癌細(xì)胞。用交互式測(cè)試法測(cè)試每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度Gα，同時(shí)在相應(yīng)的10個(gè)視野中測(cè)試背景灰度Gβ并取其平均值，每例樣本共測(cè)試200個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。該研究中測(cè)試軟件設(shè)定的Gmax為256，按下列公式計(jì)算每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性單位 PU 值，PU=|Gα-Gβ|/Gmax×100%。用于定量測(cè)試的切片不復(fù)染，用于定性拍照的切片復(fù)染。

1.5 CD34標(biāo)記的MVD結(jié)果判定血管內(nèi)皮細(xì)胞主要位于腫瘤周?chē)g質(zhì)中，被CD34染成棕黃色。微血管密度（MVD）計(jì)數(shù)方法［3］，每例先在低倍鏡下選擇MVD腫瘤區(qū)域，最高的區(qū)域在400倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)微血管數(shù)，再求其平均值。該研究中單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小或帶有較厚肌層的血管除外。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用方差分析對(duì)多樣本均數(shù)之間進(jìn)行比較。若方差不齊，組間多重比較采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；若方差齊，組間多重比較采用LSD。兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2、VEGF和 CD34蛋白的表達(dá)情況EZH2陽(yáng)性表達(dá)部位定位于細(xì)胞核，在正常乳腺組織中幾乎不著色，在乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)依次增強(qiáng)（圖1，表1）。VEGF主要定位于乳腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)，在乳腺癌間質(zhì)的纖維細(xì)胞和正常乳腺組織中有少量表達(dá)，在低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌表達(dá)無(wú)明顯差異，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)顯著增高（圖2，表1）。該研究中，CD34在不同類(lèi)型的乳腺組織中均有不同程度的表達(dá)，陽(yáng)性率100%，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒，分布不均勻，尤其是腫瘤邊緣組織呈高表達(dá)，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞多排列不規(guī)則，管腔不明顯 （圖3）。90例乳腺癌組織中EZH2和 VEGF的表達(dá)率分別為 86.67%（78/90）、80%（72/90），均高于明顯高于正常乳腺組織的13.33%（2/15）和 26.67%（4/15）。

圖1～圖3見(jiàn)封三。

表1 EZH2和VEGF在正常乳腺及乳腺癌中的PU值（）

表1 EZH2和VEGF在正常乳腺及乳腺癌中的PU值（）

VEGF PU值正常乳腺組織 15 1.82±1.24 2.37±0.96低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌 10 6.70±1.18 5.13±0.11高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌 15 12.11±1.54 5.32±0.39乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 90 13.20±4.86 12.68±4.72組別 n EZH2 PU值

2.2 EZH2、VEGF和MVD與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系EZH2和VEGF蛋白與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、pTNM分期均有關(guān)（P<0.05）。其中EZH2和VEGF在腫物直徑≤2 cm與2 cm<腫物直徑≤5 cm組間無(wú)明顯差異（P>0.05），在腫物直徑≤2 cm與腫物直徑>5 cm組間、2 cm<腫物直徑≤5 cm與腫物直徑>5 cm組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。EZH2和VEGF與患者的年齡、腫瘤的部位及ER、PR激素受體的狀態(tài)均無(wú)關(guān)（P>0.05）。MVD與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、pTNM分期均有關(guān)（P<0.05），與患者的年齡、腫瘤的部位、腫瘤大小及ER、PR激素受體的狀態(tài)均無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 EZH2、VEGF和 MVD的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示：90例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，EZH2蛋白的表達(dá)和VEGF蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（rp=0.984，P=0.000），EZH2 和 CD34 的表達(dá)呈顯著正相關(guān) （rp=0.346，P=0.000），VEGF 和 CD34 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（rp=0.321，P=0.000）。

3 討論

EZH2作為一種促癌基因，在多種腫瘤如乳腺癌［4］、結(jié)直腸癌［5］、腎癌［6］等中過(guò)表達(dá)，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)［4］EZH2蛋白在正常乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)缺失，在乳腺導(dǎo)管原位癌中表達(dá)開(kāi)始增加，其在侵襲性導(dǎo)管癌表達(dá)明顯增加。但其研究并未詳細(xì)觀察EZH2在低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌表達(dá)的差異。該研究結(jié)果顯示EZH2在乳腺正常組織中幾乎不表達(dá)，在乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌有少量表達(dá)，而其在高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)顯著增強(qiáng)，這表明EZH2直接參與了乳腺癌演變過(guò)程，是腫瘤發(fā)生早期階段的分子事件。

表2 EZH2、VEGF和MVD 與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系（）

表2 EZH2、VEGF和MVD 與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系（）

注：a1與 a2比較 P=0.181，a1與 a3比較 P=0.000，a2與 a3比較 P=0.027；b1與 b2比較 P=0.234，b1與 b3比較 P=0.001，b2與 b3比較 P=0.044。

組別 n EZH2 VEGF MVD PU值 P PU值 P 個(gè)數(shù) P年齡（歲）<50 52 13.23±4.47 0.938 12.78±4.38 0.809 22.32±8.48 0.801≥50 38 13.15±5.42 12.53±5.22 22.85±10.67部位左乳 58 13.13±4.46 0.865 12.93±4.36 0.528 21.32±8.75 0.116右乳 32 13.32±5.60 12.22±5.36 24.76±10.28腫瘤（cm）≤2 cm 39 11.55±4.50a1 0.002 11.22±4.08b1 0.005 20.08±8.33>2 cm，≤5 cm 27 13.10±3.36a2 12.57±3.62b2 23.44±8.32>5 cm 24 13.20±4.86a3 15.15±5.82b3 24.36±11.85組織學(xué)分級(jí)高分化 30 9.57±2.33 0.000 0.294 9.18±2.3420.43±9.76 54 10.73±3.12 0.000 10.32±3.23 0.000 19.86±7.53 0.002有36 16.90±4.69 16.21±4.42 26.57±10.57 pTNM分期Ⅰ～Ⅱ期 45 10.01±2.57 0.000 9.65±2.86 0.000 20.16±8.31 0.016Ⅲ～Ⅳ期 45 16.38±4.53 15.71±4.26 24.92±9.93 ER受體陰53 12.90±4.47 0.513 12.72±4.41 0.915 21.71±9.04 0.328陽(yáng)37 13.62±5.42 12.61±5.20 23.73±9.93 PR受體陰56 13.26±4.62 0.169 12.97±4.40 0.478 22.53±9.54 0.985陽(yáng)34 13.10±5.31 12.20±5.24 22.57±9.35中分化 39 12.24±2.85 11.81±3.10 20.51±6.81低分化 21 20.15±3.13 19.29±2.70 29.32±10.25淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)0.0000.001

Guo等研究顯示在300例乳腺癌組織標(biāo)本中EZH2陽(yáng)性表達(dá)率56.6%［7］。該研究90例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中EZH2表達(dá)陽(yáng)性率86.67%，明顯高于以往文獻(xiàn)報(bào)道。原因可能如下：（1）樣本含量不同；（2）研究采用的乳腺癌標(biāo)本組織學(xué)類(lèi)型不同，以往研究的乳腺癌組學(xué)類(lèi)型多樣，包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌，而該研究只涉及乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。該研究發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的年齡、腫瘤的部位及ER、PR激素受體的狀態(tài)均不相關(guān)。腫瘤>5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)低分化及pTNM分期越高，EZH2的表達(dá)增加。提示EZH2的高表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。該研究與以往文獻(xiàn)EZH2與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系基本相似［8-10］，但略有不同，以往文獻(xiàn)報(bào)道EZH2與乳腺癌內(nèi)分泌狀態(tài)相關(guān)，而該研究顯示EZH2與ER、PR激素受體均不相關(guān)，推測(cè)其原因可能是對(duì)免疫組化結(jié)果的判讀采用了定量研究方法，以往免疫組化采用定性判讀的方法。

腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移離不開(kāi)新生毛細(xì)血管的形成。VEGF能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞分裂和毛細(xì)血管出芽生長(zhǎng)，為腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移提供相對(duì)有利的微環(huán)境［11］。在所有內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物中，CD34蛋白抗原特異性及靈敏性高，常用于檢測(cè)組織微血管密度是反映血管形成活躍程度的特異性抗體。有研究表明MVD與乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為判斷乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病情進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的有效參考指標(biāo)［12］。該研究顯示 VEGF和MVD與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、pTNM分期均有關(guān)，VEGF蛋白還與腫瘤的直徑相關(guān)，這提示VEGF和MVD是預(yù)測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌惡性程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。該研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道VEGF和MVD在乳腺癌中的表達(dá)基本相似［13，14］。

有關(guān)于EZH2和VEGF二者關(guān)系的研究在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)在外陰癌、肝癌、膀胱癌中的相關(guān)性已有文獻(xiàn)報(bào)道［15-17］。研究認(rèn)為EZH2和VEGF二者在外陰癌和膀胱癌中均呈正相關(guān)，而在肝癌中二者無(wú)明顯相關(guān)性。EZH2和VEGF在不同部位癌組織中表達(dá)相關(guān)性具有差異，可能與組織形態(tài)的差異有關(guān)。該研究中筆者把EZH2、VEGF和MVD三者結(jié)合起來(lái)，更直觀地反映了EZH2與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。該研究結(jié)果顯示乳腺癌中EZH2蛋白的表達(dá)和VEGF蛋白及MVD呈顯著正相關(guān)，VEGF和MVD的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，這表明EZH2與VEGF在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中可能存在協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，EZH2蛋白在正常乳腺組織中不表達(dá)，在低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中依次升高，該蛋白的高表達(dá)提示腫瘤惡性增殖、分化差、淋巴結(jié)易轉(zhuǎn)移和較高的臨床分期，EZH2蛋白的表達(dá)與VEGF和MVD的表達(dá)呈顯著相關(guān)，EZH2的高表達(dá)可能促進(jìn)了VEGF的表達(dá)和腫瘤血管密度的增加，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。EZH2蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中調(diào)控VEGF和腫瘤血管密度的具體機(jī)制可以作為后續(xù)的研究。