小龍蝦疾病的病原檢測

宮子慧

近年來，克氏原螯蝦（俗稱小龍蝦）的消費量不斷增加，人工養殖面積持續擴大，泗洪縣小龍蝦的養殖模式主要以稻蝦綜合種養為主。2018年5月起，我縣部分養殖戶的小龍蝦出現死亡，病蝦主要表現為頭胸甲易剝離、肝胰腺顏色淡黃、螯肢及附肢無力、反應遲鈍、應激能力較弱、在頭胸甲部位常出現白斑。筆者通過對病蝦肝胰腺的細菌分離及鑒定，和PCR法分子檢測技術來探討引起小龍蝦發病的原因。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

病蝦樣本來自泗洪縣青陽鎮、曹廟鄉、孫園鎮、城頭鄉等鄉鎮的6個發病的養殖塘口，樣本的采樣編號、采集時間及地點見表1。

表1 小龍蝦病樣采集信息

表2 鑒定試劑條檢測結果

表3 2株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對照表 mg/L

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗

用滅菌棉簽蘸取小龍蝦肝胰腺，均勻涂于普通營養瓊脂培養基上和TCBS培養基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養18-24h后，觀察菌落形態，并挑取可疑單個菌落劃線接種在營養瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃、37℃恒溫培養18-24h。

挑取純化過的細菌制成0.5麥氏單位的菌懸液，采用腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）系統測定各分離菌株生理生化特性，同時做氧化酶反應構成第21個試驗，并用南京菲恩醫療科技有限公司的動物用藥敏分析試劑板進行藥敏試驗。

1.2.2 WSSV 核酸提取及檢測

從病蝦中取約100mg鰓組織，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒的說明進行DNA提取，對WSSV DNA樣本采用《GB /T 28630.2-2012白斑綜合征（ WSD）診斷規程第2部分套式PCR 檢測法》為標準進行檢測。PCR擴增體系總量為50μL，分別為：25μL Mix Taq酶（ Takara），18μL無菌水，1 μL正向引物，1 μL反向引物，5μL模板。PCR產物通過用50×TAE電泳緩沖液配制的1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

圖 3 WSSV PCR檢測結果

2 結果

2.1 病原菌的鑒定藥敏試驗

從小龍蝦肝胰腺分離到的細菌在營養瓊脂平板上為光滑、濕潤、微凸、淡黃色菌落，在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落。對分離的2株細菌進行生理生化檢測，結果判定：分別為嗜水氣單胞菌和霍亂弧菌，具體生理生化特性見表 2。

2.2 病原菌的藥敏試驗結果

2株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表3所示。

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗執行標準，嗜水氣單胞菌對紅霉素為耐藥，對其他7種抗菌藥物均敏感，霍亂弧菌對紅霉素為中敏，對其他7種抗菌藥物均敏感。

2.3 WSSV PCR檢測結果

PCR檢測結果顯示病蝦WSSV病毒陽性檢出率為100%，如圖3所示。

M∶DNA Marker（自上到下依次為2000、1000、750、500、250、100bp）；1.陽性對照；2.陰性對照；3.采樣編號SH18050301；4.采樣編號4SH18050302；5.采樣編號SH18050303；6.采樣編號SH18050304；7.采樣編號SH18060601；8.采樣編號SH18060602

3 討論與分析

從生病小龍蝦肝胰腺分離到的2個細菌，根據其培養后的菌體形態特征、生化特性分析結果，分別確定為嗜水氣單胞菌和霍亂弧菌。通過藥敏試驗表明兩種菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素均敏感。

PCR結果表明所有小龍蝦中都感染了WSSV（白斑綜合征病毒）。WSSV為一種無包涵體病毒，地理分布廣，流行范圍大，傳染性強，對發病蝦致死時間短，目前尚無有效的治療藥物，還不能有效地控制疫情，因此在小龍蝦養殖過程中應加強疾病的預防。控制合理的放苗密度，規格200尾左右/kg的蝦苗畝均放養量不超過30kg，苗種健康，養殖過程中加強飼料投喂，提早投喂精飼料，顆粒飼料蛋白含量36%以上，提高蝦的抗病力，調控好水質，定期潑灑氯制劑或碘制劑進行水體消毒，移植培育好水草，營造良好的池塘環境，同時每7-10天使用過硫等底改產品改善養殖池底環境，定期內服黃芪多糖等增強免疫力的產品。如果在養殖過程中出現死蝦，應認真處理好死亡的病蝦，在遠離養殖塘處掩埋病蝦，杜絕病毒的進一步擴散。