子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞和雌三醇變化及相關性分析*

李 穎，丁 淵，陳麗麗，許 浩

(浙江省杭州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科 310006)

世界范圍內孕婦出現子癇前期的比例為5%～20%，高齡偏胖的孕婦、有家族遺傳史的孕婦及自身合并內科疾病的孕婦為好發(fā)群體，發(fā)病與遺傳、環(huán)境等多種因素相關[1]。該病對母體及胎兒的危害較大，嚴重者危及生命，臨床上一般通過規(guī)范產檢來提前診斷，也可在孕早期補充鈣劑有效預防。免疫耐受是子癇前期發(fā)病機制之一，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在機體的免疫耐受中起重要作用，同時有學者在體外試驗中發(fā)現，雌激素可促進Foxp3的表達[2]。本研究針對子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞和雌三醇變化進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年7月本院就診的50例子癇前期患者。納入標準：(1)符合子癇前期的診斷標準[3]；(2)初產婦，且無相關產科并發(fā)癥；(3)心、肝、腎等器官無重大疾病；(4)無血液系統(tǒng)疾病及免疫治療史；(5)所有患者對本次研究知情并簽署同意書。根據病情不同將患者分為輕度子癇前期組(24例)和重度子癇前期組(26例)，輕度子癇前期組平均年齡(30.16±4.57)歲，平均孕周(36.15±4.09)周；重度子癇前期組平均年齡(31.25±5.21)歲，平均孕周(35.69±4.97)周；選取同期健康孕婦25例為對照組，平均年齡(30.67±4.39)歲，平均孕周(35.98±4.43)周。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1試驗方法 所有患者入組后第2天晨起抽取空腹肘靜脈血5 mL，Treg流式檢測步驟如下：(1)提取，使用淋巴細胞分離液制備外周血單個核細胞(PBMCs)；(2)洗滌，使用PBS洗滌后制備PBMCs懸液；(3)染色，首先進行細胞表面染色，將3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)滴加至200 μL 外周血PBMCs懸液中，1 500 r/min離心5 min后去除上清液，再將15 μL的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD4抗體和藻紅蛋白(PE)標記的CD25抗體滴加至500 μL PBS重懸稀釋到1×106個/mL的細胞中。室溫下避光30 min，加入2 mL冷PBS，重復1 500 r/min離心5 min。然后進行細胞內染色，于室溫避光條件下孵育2 h，將2 mL透膜緩沖液滴加至破膜劑重懸細胞中，離心洗滌后加入15 μL的PE-Cy5標記的Foxp3抗體，室溫下避光30 min，加入2 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，最后加入500 μL PBS重懸；(4)上機檢測，設置相應對照管，采用BD FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)檢測。

表1 3組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞情況比較

圖1 流式細胞儀分選圖

表2 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平比較

采用實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測PBMCs Foxp3 mRNA表達情況，具體步驟如下：取上述實驗制備的PBMCs，PBS洗滌1次后去除PBS，加入Trizol液1 mL，收集細胞并提取總RNA，利用分光光度計測量A260/A280，最終計算RNA樣品的濃度及純度。合成少量cDNA作為模板，進行PCR擴增。反應體系為20 μL，按照說明書進行RT-PCR反應。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，通過比較CT值計算mRNA相對表達水平。GAPDH和Foxp3的引物序列參考文獻[4]。

另取各組孕婦晨起8：00空腹肘靜脈血5 mL，經抗凝離心后獲得血漿，按照游離雌三醇定量檢測試劑盒(河南美凱生物科技有限公司，規(guī)格:48份/盒)采用順磁性顆粒化學發(fā)光免疫測定法操作測定患者外周血中游離雌三醇的水平。

1.2.2觀察指標 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞絕對數、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例、PBMCs Foxp3 mRNA表達水平及患者外周血中游離雌三醇的水平。

2 結果

2.13組外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞情況比較 輕度子癇前期組和重度子癇前期組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞絕對數和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T均低于對照組(P<0.05)。同時，重度子癇前期組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞絕對數和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例均低于輕度子癇前期組(P<0.05)，見表1、圖1。

2.23組PBMCs Foxp3 mRNA情況 輕度子癇前期組與重度子癇前期組PBMCs Foxp3 mRNA水平較對照組明顯降低，而重度子癇前期組低于輕度子癇前期組(P<0.05)。子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平呈正相關(r=0.779,P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與PBMCs Foxp3 mRNA水平的線性相關圖

2.33組血清雌三醇情況比較 輕度子癇前期組[(6.17±2.15)mg/L]和重度子癇前期組[(3.28±1.12)mg/L]血清雌三醇均低于對照組[(11.32±2.45)mg/L，F=15.279,P<0.05]；同時，輕度子癇前期組血清雌三醇高于重度子癇前期組(P<0.05)。子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與血清雌三醇水平呈正相關(r=0.584,P<0.05)，見圖3。

圖3 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與血清雌三醇水平的線性相關圖

3 討論

子癇前期是妊娠期婦女特有且較為常見的一種疾病，又稱先兆子癇，即在高血壓的情況下出現抽搐癥狀[5]，我國發(fā)病率約在9%，孕產婦病死率占到妊娠相關死亡人數的10%～16%，是造成孕產婦死亡的第2大原因[6]。在疾病早期，患者可能無癥狀或出現輕度血壓升高、輕度蛋白尿伴水腫，重度患者會出現頭暈眼花、惡心嘔吐、明顯血壓升高、蛋白尿增多等現象，甚至抽搐昏迷，危及生命[7-8]。目前臨床上一般根據患者的臨床癥狀、超聲心動圖、胎心監(jiān)護、腦CT或磁共振(MRI)等檢查及遺傳病史來進行診斷治療，通過合理使用硝苯地平等降壓藥進行降壓治療，用硫酸鎂解痙，臥床休息甚至終止妊娠等方式來盡可能降低患者死亡率，保護母嬰健康。在孕早期及時補充鈣劑也是有效預防措施之一[9]。

子癇前期被認為是母體免疫系統(tǒng)對滋養(yǎng)層父系來源的抗原異常反應的結果，胚胎成功生長的關鍵是免疫耐受，而母體對胚胎無法產生足夠的免疫耐受是子癇前期的發(fā)病機制之一[10-11]。由于CD4+CD25+Treg細胞有著抑制機體免疫活性的強大功能，所以它在免疫耐受中扮演著重要角色，也是內環(huán)境穩(wěn)定的守護者，能夠有效抑制機體對異體物質的排斥[12-13]。目前臨床上已無輕度子癇前期的診斷，為了便于本次研究，仍將患者根據病情輕重分為輕度和重度，從結果來看，重度子癇前期組CD4+CD25+Treg細胞比例明顯低于輕度子癇前期組和對照組(P<0.05)，輕度子癇前期組CD4+CD25+Treg細胞比例也顯著低于對照組(P<0.05)，也就是說CD4+CD25+Treg細胞與子癇前期的發(fā)病機制具有相關性。

Foxp3是一種存在于細胞質的轉錄因子，對CD4+CD25+Treg細胞起到控制作用[14]，同時CD4+CD25+Treg細胞受Foxp3 mRNA和其轉錄蛋白質的特異性作用。正常情況下妊娠早期CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞顯著增加，中期稍弱，分娩后顯著減少，但孕婦處于子癇前期會導致該細胞水平降低，降低程度受病情嚴重影響[15]。如本研究結果中，輕度子癇前期組與重度子癇前期組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞絕對數、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg比例均低于對照組(P<0.05)，同時，重度子癇前期組患者指標均低于輕度子癇前期組(P<0.05)。子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平呈正相關。此外，雌激素水平在妊娠過程中發(fā)揮重要作用，可通過調節(jié)免疫耐受影響孕婦的妊娠結局[16]。在體外實驗中，研究發(fā)現雌激素還可通過對性腺軸的調節(jié)增加Foxp3水平，同時使CD4+CD25+Treg細胞數量增多，但具體機制尚未闡明，有學者推測雌激素對免疫功能的調節(jié)作用可能通過調節(jié)Foxp3 等諸多轉錄因子的表達而完成[17]。雌三醇可抑制妊娠期T細胞的明顯偏移，增強其活性，促進功能，作用也是舉足輕重。而本研究也證明輕度子癇前期組和重度子癇前期組血清雌三醇顯著低于對照組(P<0.05)，同時，輕度子癇前期組血清雌三醇也明顯高于重度子癇前期組(P<0.05)，證實了子癇前期狀態(tài)下CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數和雌三醇水平出現顯著下降，在相關性分析中發(fā)現子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與血清雌三醇水平呈正相關，但二者間的作用機制有待進一步探究。

綜上所述，子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞明顯減少，同時血清雌三醇也有所下降，這可能與子癇前期的發(fā)病機制及免疫耐受有關。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在子癇前期的發(fā)病機制中占據重要地位，后續(xù)研究應進一步探究子癇前期的發(fā)病機制，為臨床防治提供理論依據。