急性白血病相關巨噬細胞的性質及rhIFN-γ對其影響的研究*

宋建新，歐陽紅梅，聞 艷,撒亞蓮

(云南省第一人民醫院:1.檢驗科；2.血液科；3.臨床基礎研究所，昆明 650032)

巨噬細胞是一類具有遷移性、異質性的免疫細胞；在不同微環境中，其可被招募并極化為具有不同分子特征和功能的亞群，即M1型或M2型，M1型與M2型巨噬細胞通過分泌白細胞介素(IL)-12和IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子，參與促腫瘤或抗腫瘤作用[1-3]。前期本課題組應用巨噬細胞的泛標志物CD68(M1型+M2型)、CD163(M2型)，研究了慢性粒細胞白血病(CML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)骨髓微環境中巨噬細胞的變化發現，巨噬細胞被大量募集進入CML及MDS患者骨髓微環境，并逐漸向M2型極化，與疾病的發生、發展及預后有密切關系[4-6]。那么，在急性白血病(AL)患者骨髓微環境中，是否存在巨噬細胞的過度浸潤，是以M1型為主或M2型為主或二者兼有，是否與AL的發生、發展及預后有關；重組人干擾素-γ(rhIFN-γ)對其在荷瘤情況下的干預是有利于溶癌，還是有利于腫瘤逃逸，這些都是有意義、值得明確的科學問題，本課題組將對其進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2017年5月初診AL患者97例，其中男58例，女39例，男女比例為1.49∶1.00；年齡8個月至82歲，平均(40.90±14.54)歲。97例AL患者中，急性髓系白血病(AML組)71例，其中M0 5例，M1 8例，M2 5例，M3 12例，M4 23例，M5 18例，年齡7～82歲，平均(45.26±13.31)歲；急性淋巴細胞白血病(ALL組)26例，其中B細胞型(B)-ALL 19例，T細胞型(T)-ALL 7例，年齡8個月至72歲，平均(43.62±16.18)歲。在97例AL患者中，追蹤觀察53例經標準化療1～2個療程患者，共有37例達到形態學完全緩解(CR)，其中AML 24例、ALL 13例，年齡4～69歲，平均(44.59±11.82)歲；16例未緩解(NR)或部分緩解(PR)，其中AML 8例、ALL 8例，年齡11～76歲，平均(46.47±16.58)歲。追蹤觀察37例CR患者，有8例復發，其中AML 2例、ALL 6例，年齡14～69歲，平均(42.35±12.74)歲。診斷、緩解及復發標準符合AL標準[7]。選取同期體檢的30例健康者為對照組，排除血液系統惡性疾病、免疫相關及感染相關疾病，其中男18例，女12例，男女比例為1.50∶1.00，年齡11～76歲，平均(47.50±10.24)歲。本研究獲醫院倫理委員會批準，并征得所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 鼠抗人CD68、CD163抗體，SP免疫組織化學試劑盒購自美國Abcam公司；IL-10、TNF-α試劑盒購自美國BD公司；淋巴細胞分離液購自中國天津昊陽生物公司；rhIFN-γ購自上海凱茂生物醫藥有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；FC500流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；細胞培養24孔板購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.2免疫組織化學檢測CD68、CD163 常規骨髓穿刺取骨髓組織，置于10%福爾馬林液固定，經脫水、石蠟包埋、3～4 μm厚切片；采用SP免疫組織化學染色檢測CD68、CD163的表達。巨噬細胞體積較大，形態多樣，呈類圓形或不規則形，偶見多核細胞；CD68陽性表達于巨噬細胞的細胞質，細胞質含清晰的黃褐色至棕黃色顆粒狀者為陽性細胞；CD163陽性表達于巨噬細胞的細胞膜和(或)細胞質，細胞膜和(或)細胞質出現清晰的黃褐色至棕黃色顆粒狀者為陽性細胞，見圖1。免疫組織化學染色結果由兩位病理醫師各自獨立判斷，結果相同為最終檢驗結果，若有異議，由上級醫師進行最終判斷。首先在低倍鏡(×40)下選取5個染色較好的視野，后在高倍鏡(HP，×400)下計數陽性細胞個數,取其平均值作統計學分析。

1.2.3AL患者骨髓單個核細胞培養及rhIFN-γ的干預作用 取AML患者骨髓液2.0～3.0 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，用淋巴細胞分離液常規分離獲取單個核細胞,9.0 g/L生理鹽水洗滌單個核細胞2次；用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養液調整單個核細胞濃度為1×105/mL，以每孔1.0 mL接種于24孔培養板中，每組設5個平行孔，每孔分別加入終濃度為0、4×104、2×105、1×106U/L的rhIFN-γ，CO2培養箱培養7 d，經EDTA消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用流式細胞儀檢測 CD68+、CD163+細胞；收集培養上清液，用于IL-10、TNF-α檢測。

1.2.4CD68+、CD163+細胞檢測 于2支流式專用試管中加入細胞溶液100 μL，對照管中加入IgG1-藻紅蛋白(PE)、IgG1-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體各20 μL；測定管加入CD68-PE、CD163-FITC抗體各20 μL，混勻后室溫下避光孵育30 min；用PBS洗滌，棄上清液，加入500 μL PBS混勻，上機測定。

1.2.5細胞因子檢測 IL-10、TNF-α水平測定按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.13組治療前骨髓中CD68+、CD163+細胞的表達情況 AML組和ALL組患者CD68+和CD163+細胞的浸潤密度均高于對照組(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)；而AML組與ALL組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 3組治療前CD68+、CD163+細胞水平比較個/HP)

a：P<0.05，對照組比較

圖1 不同狀態AL患者骨髓中CD68+、CD163+細胞的表達情況(免疫組織化學染色，×400)

表2 不同狀態AL患者骨髓中CD68+、CD163+細胞水平比較個/HP)

a：P<0.05，與AL患者比較；b：P<0.05，與對照組比較；c：P<0.05，與CR患者比較

表3 CR與NR/PR患者治療前CD68+、CD163+細胞水平比較個/HP)

2.2不同狀態AL患者骨髓中CD68+、CD163+細胞表達情況 CR患者CD68+、CD163+水平低于AL患者，而高于對照組(P<0.05)；NR/PR患者與復發患者和初診AL患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖1。

2.3CR患者與NR/PR患者CD68+、CD163+細胞表達情況 CR患者CD68+、CD163+水平低于NR/PR患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖1。

2.4不同濃度rhIFN-γ對AML骨髓單個核細胞干預后CD68+、CD163+變化情況 AML組骨髓單個核細胞經不同濃度rhIFN-γ干預7 d后，CD68+水平隨著干預濃度的增高而逐漸升高，但在各干預濃度間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；CD163+水平隨著干預濃度的增高而逐漸降低，當干預濃度大于或等于2×105U/L時，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；而當干預濃度為1×106U/L時，CD163+與CD68+水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 不同濃度rhIFN-γ對AML組骨髓單個核細胞干預后CD68+、CD163+的變化情況

a：P<0.05,與0 U/L比較；b:P<0.05，與CD68+細胞比較

2.5不同濃度rhIFN-γ對AML骨髓單個核細胞干預后IL-10、TNF-α變化情況 IL-10水平隨著干預濃度的增高而降低，TNF-α水平則隨著干預濃度的增高而升高，當干預濃度為1×106U/L時，IL-10和TNF-α水平與0 U/L分別比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

圖2流式細胞儀檢測不同濃度rhIFN-γ對AML組骨髓單個核細胞干預后CD68+、CD163+變化情況

表5 不同濃度rhIFN-γ對AML組骨髓單個核細胞干預后IL-10、TNF-α變化情況

a：P<0.05，與0 U/L比較

3 討論

AL是因造血干/祖細胞于分化過程中在較早階段發生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質性造血系統惡性腫瘤。目前，隨著對AL治療技術的不斷進步，尤其是骨髓移植和造血干細胞移植的發展應用，AL治愈率得到明顯提高，但對微小殘留的清除仍是棘手的問題，這也是CR后復發的原因之一。有研究顯示，在多發性骨髓瘤患者骨髓中存在M2型巨噬細胞的異常浸潤，且與疾病的發生、發展及預后有關[8]，但在AL患者骨髓微環境中巨噬細胞的浸潤及極化表型還鮮見報道。

rhIFN-γ是由活化T細胞、自然殺傷細胞產生分泌的細胞因子之一，有著“雙刃劍”作用，在腫瘤組織中有正向抗腫瘤作用，還有誘導腫瘤細胞免疫逃逸的負向作用[9]，其除發揮直接作用外，還間接調節其他免疫細胞，如巨噬細胞[10]。有文獻報道，rhIFN-γ可將M2型巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞，參與輔助性T細胞(Th)1型免疫應答[11]。

通過對AL患者骨髓巨噬細胞的研究發現，在初診AL患者中，無論AML還是ALL患者骨髓中均有CD68+、CD163+巨噬細胞的異常浸潤，且浸潤的巨噬細胞以M2型(即CD163+)為主，提示AL患者骨髓微環境中M2型巨噬細胞可能通過自分泌和(或)旁分泌途徑參與白血病細胞的惡性增殖、抵抗凋亡及侵襲[12-13]，導致AL的發生、發展。追蹤觀察53例初治AL患者的CD68+、CD163+還發現，治療1～2個療程達CR的患者，CD163+的浸潤密度明顯低于NR/PR患者，提示骨髓中M2型巨噬細胞浸潤數量與AL患者的療效、預后有直接關系，即治療前M2型巨噬細胞浸潤密度高的患者對治療反應差。在追蹤CR后又復發8例患者，M2型巨噬細胞與初診患者骨髓中M2型巨噬細胞比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示M2型巨噬細胞具有促進白血病干細胞(LSCs)的生存、遺傳的不穩定性及克隆演變，這可能為探討針對巨噬細胞的靶向治療AL，清除白血病微小殘留提供理論依據。

本研究還顯示，CR患者骨髓組織中的M2型巨噬細胞有所降低，但仍明顯高于對照組，說明AL患者骨髓雖然達到形態學和(或)基因水平上的暫時緩解，但促進LSCs生存、分化、增殖的因素還未完全消除，這也可能是AL最終復發的原因之一。

對rhIFN-γ干預的研究結果顯示，CD68+占所有單個核細胞的百分率隨著干預濃度的增加略有升高，CD163+略低于CD68+，但與rhIFN-γ為0 U/L比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示在初診AL患者骨髓中，主要是M2型巨噬細胞占優勢；而隨著干預濃度的逐漸增高，M2型巨噬細胞也逐漸降低，說明在rhIFN-γ干預后，已有部分M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，提示rhIFN-γ在AL荷瘤情況下具有將M2型巨噬細胞向M1型“逆轉”的作用，這也間接證實了IL-10隨著rhIFN-γ干預濃度的增加應逐漸降低，而TNF-α隨著干預濃度的增加應逐漸增高。

綜上所述，AL患者骨髓微環境中巨噬細胞被大量招募并被極化為M2型巨噬細胞，使骨髓微環境發生變化，可能與AL的發生、療效、預后相關。在AL荷瘤情況下，一定濃度的rhIFN-γ具有將M2型向M1型巨噬細胞“逆轉”的功能。