ATRA對(duì)高糖培養(yǎng)條件下HMC炎性因子表達(dá)的影響及其機(jī)制研究*

陳艷霞，秦曉華，黃 翀，涂衛(wèi)平

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南昌 330006)

糖尿病的相關(guān)并發(fā)癥是全球重大的健康問題之一，其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病并發(fā)癥中最重要的醫(yī)學(xué)問題，約有1/3的糖尿病患者并發(fā)了DN[1]，也成為終末期腎臟病的主要原因[2-3]，產(chǎn)生了嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。近年來，對(duì)DN病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)和了解發(fā)生了一些變化，既往觀點(diǎn)認(rèn)為DN的腎臟損害是由于代謝和血流動(dòng)力學(xué)的影響導(dǎo)致腎小球內(nèi)壓力增加，以及高血糖狀態(tài)本身對(duì)腎臟的損傷作用。目前DN的發(fā)病機(jī)制演變成了更為復(fù)雜的情況，由多因素影響造成，甚至遺傳和環(huán)境因素都參與觸發(fā)了DN復(fù)雜的病理生理機(jī)制[5]。近年來的研究越來越關(guān)注炎癥在DN發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，深入了解炎癥在DN發(fā)病機(jī)制中的作用特征將可能成為DN治療策略的潛在新靶點(diǎn)。因此，本研究觀察了全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)對(duì)高糖培養(yǎng)條件下人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cells，HMC)炎性因子表達(dá)的干預(yù)作用，探討ATRA對(duì)DN的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器 HMC購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，ATRA、NF-κB通路抑制劑(Bay11-7082)、D-葡萄糖、甘露醇均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMEN/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自澳大利亞GIBCO公司，Trizol引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自北京全式金公司，ELISA試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。核酸微量蛋白測(cè)定儀、PCR擴(kuò)增儀、凝膠圖像成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，DYPC-31DN型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HMC培養(yǎng)條件：用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度調(diào)整為37 ℃，CO2水平為5%，待HMC在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至80%～85%融合時(shí)進(jìn)行傳代至6孔培養(yǎng)板，傳代生長(zhǎng)至約80%融合后改不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為7個(gè)組，分別為正常對(duì)照組(Ⅰ組，未加任何刺激物)、高糖干預(yù)組(Ⅱ組，加入高糖)、滲透壓對(duì)照組(Ⅲ組，加入甘露醇)、NF-κB通路抑制劑組(Ⅳ組，高糖+Bay11-7082)、高糖+低劑量ATRA組(Ⅴ組，高糖+低劑量ATRA)、高糖+中劑量ATRA組(Ⅵ組，高糖+中劑量ATRA)、高糖+高劑量ATRA組(Ⅶ組，高糖+高劑量ATRA)。Ⅰ組、Ⅲ組D-葡萄糖水平為5.5 mmol/L；Ⅱ組D-葡萄糖水平為30.0 mmol/L；Ⅲ組甘露醇水平為24.5 mmol/L；Ⅳ組Bay11-7082水平為30.0 μmol/L；Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組D-葡萄糖水平均為30.0 mmol/L，ATRA水平分別為1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L。所有組干預(yù)48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2RT-PCR檢測(cè) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別進(jìn)行RNA的提取，RT-PCR檢測(cè)各組NF-κB、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA的表達(dá)。NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α、β-actin的引物由美國(guó) Invitrogen 公司設(shè)計(jì)合成，NF-κB正向引物：5′-GAT TTC GTT TCC GTT AGT-3′，反向引物：5′-TTT GCT GGT CCC ACA TAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為540 bp。IL-6正向引物：5′-AGG AGA CTT GCC TGG TGA AA-3′，反向引物：5′-CAG GGG TGG TTA TTG CAT CT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為180 bp。IL-1正向引物：5′-GAA TGACGCCCTCAATCAAAGT-3′，反向引物：5′-TCA TCT TGG GCA GTC ACA TAC A-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為400 bp。TNF-α正向引物：5′-TCT TCT CGA ACC CCG AGT GA-3′，反向引物：5′-TGA GGT ACA GGC CCT CTG AT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為163 bp。β-actin正向引物：5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′，反向引物：5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為443 bp。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，共32個(gè)循環(huán)。使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳。使用凝膠成像系統(tǒng)成像后圖片使用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.3ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別收集各組上清液，按IL-6、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒的說明進(jìn)行操作，獲得吸光度(OD)值，用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出各組IL-6、TNF-α表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1各組NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 Ⅰ組與Ⅲ組NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅱ組NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平均較其他組高(P<0.05)；Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平較Ⅱ組低(P<0.05)；且隨著ATRA水平升高，NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平逐漸降低，見圖1、2。

圖1 各組NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

1:Marker；2：Ⅰ組；3：Ⅱ組；4.Ⅲ組；5：Ⅳ組；6：Ⅴ組；7：Ⅵ組；8：Ⅶ組

圖2各組PCR情況比較

2.2各組IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較 Ⅰ組與Ⅲ組IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅱ組IL-6、TNF-α表達(dá)水平均較其他組明顯升高(P<0.05)；Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組IL-6、TNF-α表達(dá)水平較Ⅱ組明顯降低(P<0.05)，且隨著ATRA水平升高，IL-6、TNF-α表達(dá)水平逐漸降低，見圖3。

圖3 各組IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較

3 討論

有證據(jù)明確顯示糖尿病的并發(fā)癥與炎性因子有關(guān)[6]，DN患者血漿中炎性因子的水平明顯升高[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，DN患者血漿中炎性因子的水平隨著DN的進(jìn)展而升高[8]，且與尿清蛋白的排泄相關(guān)[9]，是腎小球和腎小管間質(zhì)損害的直接臨床標(biāo)志物。炎性細(xì)胞在腎臟的沉積與DN的發(fā)生密切相關(guān)[10]。炎性因子如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞黏附分子在DN的腎損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。已被證實(shí)，抑制炎性細(xì)胞在腎臟的沉積對(duì)DN有保護(hù)作用[12]。總之，這些結(jié)果均表明炎癥是DN發(fā)生、發(fā)展的重要的致病因素[13]。在糖尿病腎小球中的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[14]及一些分子如趨化因子[15]、黏附分子[16]、生長(zhǎng)因子[17]、核因子[18]和細(xì)胞因子[13]等均與DN的多種致病途徑有關(guān)。

NF-κB的激活是炎性反應(yīng)的基礎(chǔ)，DN患者中NF-κB的水平明顯升高[19]。NF-κB在炎性反應(yīng)中起著調(diào)控的作用，其活性受細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的雙重正負(fù)反饋調(diào)節(jié)[20]。當(dāng)炎性反應(yīng)發(fā)生的時(shí)候，細(xì)胞外的正反饋調(diào)節(jié)促進(jìn)炎性反應(yīng)的信號(hào)擴(kuò)大，同時(shí)激活TNF-α和IL-1的轉(zhuǎn)錄，這兩種細(xì)胞因子又可以反過來調(diào)節(jié)NF-κB的分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，促炎癥免疫受體(Fcγ Rs)與NF-κB有關(guān)，F(xiàn)cγ Rs通過外周血中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用，促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活。且Feγ Rs有兩種表型——激活型和抑制型，當(dāng)Feγ Rs被激活時(shí)，意味著NF-κB信號(hào)通路的激活，C反應(yīng)蛋白為炎癥狀態(tài)的指標(biāo)，當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活時(shí)，其在血清中的水平明顯升高，提示DN患者的炎性反應(yīng)與 NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，抑制NF-κB的活性及抗炎治療為DN的潛在治療策略。

ATRA是天然維生素A的主要衍生物，主要通過與細(xì)胞核上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，對(duì)細(xì)胞及組織具有抑制增生、調(diào)節(jié)凋亡及誘導(dǎo)分化等作用，不僅如此，其還對(duì)多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激酶具有調(diào)節(jié)作用，尤其在炎癥及免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[21]。KARKENI等[22]采用人的脂肪細(xì)胞及脂肪組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，予以ATRA進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，ATRA對(duì)脂肪細(xì)胞及脂肪組織的炎性因子如TNF-α、IL-6及趨化因子等的產(chǎn)生發(fā)揮顯著的抑制作用，意味著ATRA可對(duì)肥胖及其并發(fā)癥的治療發(fā)揮作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路的活性有關(guān)。SIERRA-MONDRAGON等[23]發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DN動(dòng)物模型中，IL-1、TNF-α及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)明顯增多，同時(shí)細(xì)胞因子(CCL2、CCL20、CXCL5、CXCL7)、黏附分子[細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、L選擇素(L-selectin)]和生長(zhǎng)因子[巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)]在腎小球和腎小管的表達(dá)也明顯升高，而ATRA可以明顯降低上述炎性因子的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)ATRA減輕炎性反應(yīng)的機(jī)制與ATRA抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路從而阻止NF-κB在腎小球和腎小管中的核易位有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療中，ATRA可以通過NF-κB信號(hào)通路的活化改善急性早幼粒細(xì)胞炎性因子的表達(dá)[24]。

本研究結(jié)果顯示，予以高糖干預(yù)的HMC其NF-κB、IL-6、IL-1、TNF-α mRNA的表達(dá)水平及IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯升高；予以ATRA干預(yù)后，觀察到ATRA可以顯著抑制HMC炎性因子的表達(dá)，且隨著ATRA水平的升高，其抑制作用更加明顯，提示高糖能促進(jìn)HMC炎性因子的表達(dá)，ATRA可干預(yù)高糖培養(yǎng)條件下HMC炎性因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)阻斷NF-κB信號(hào)通路后，Ⅳ組HMC表達(dá)IL-6、IL-1、TNF-α mRNA及IL-6、TNF-α水平較Ⅱ組減少，提示ATRA通過抗炎發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制可能與阻斷NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

DN的發(fā)病機(jī)制與炎癥密切相關(guān)，而ATRA對(duì)于高糖誘導(dǎo)的HMC具有明顯改善炎癥狀態(tài)的作用，因此，其有望成為治療DN的新策略。