針康法通過(guò)抑制NF-кB信號(hào)通路對(duì)糖尿病腦卒中大鼠骨骼肌IRS-1mRNA、PI3KmRNA的表達(dá)影響

孫妲男 鄭 劍 唐 強(qiáng) 李 勇*

（1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

糖尿病患者并發(fā)腦卒中已經(jīng)成為糖尿病患者致殘及致死的主要原因之一[1]，而現(xiàn)代康復(fù)醫(yī)學(xué)對(duì)于糖尿病腦卒中發(fā)生后的神經(jīng)功能障礙康復(fù)效果有限，我國(guó)學(xué)者創(chuàng)新性地將中醫(yī)針灸頭穴叢刺與康復(fù)療法相結(jié)合，發(fā)明的針康法[2]目前已應(yīng)用于臨床并獲得滿(mǎn)意效果，但是其具體作用機(jī)制仍未闡明，本研究擬建立糖尿病腦卒中大鼠模型，探究針康法對(duì)糖尿病腦卒中大鼠骨骼肌NF-кB信號(hào)通路的抑制作用及其對(duì)IRS-1mRNA、PI3KmRNA的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料：采用SPF級(jí)體質(zhì)量190～210 g的健康雄性SD大鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本研究經(jīng)學(xué)校倫理委員會(huì)通過(guò)。美國(guó)Moticam-3000 顯微攝影成像系統(tǒng)；美國(guó)安捷倫MX3005P 熒光定量PCR儀。

1.2 模型制備：成年雄性SD大鼠高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后一次性腹腔注射現(xiàn)配2%的鏈脲佐菌素（35 mg/kg），糖尿病大鼠模型建立[3]。隨后制備大鼠局灶性腦缺血模型，操作參照Longa改良線(xiàn)栓法[4]：用直徑0.26 mm魚(yú)線(xiàn)制作長(zhǎng)約30 mm的栓線(xiàn)，于18 mm處標(biāo)記，頭端燒圓。大鼠禁食6 h后予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）行腹腔注射麻醉。行頸部正中切口，小心分離出左側(cè)頸內(nèi)、外、總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈主干及頸總動(dòng)脈近心端，于頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端置線(xiàn)，動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈分叉處，距分叉處以上0.4 mm行“V”形切口，栓線(xiàn)插入至標(biāo)記刻度，避免進(jìn)入翼腭動(dòng)脈，使線(xiàn)栓越過(guò)大腦中動(dòng)脈至大腦前動(dòng)脈起始部，結(jié)扎備線(xiàn)，復(fù)位甲狀腺并縫合切口。術(shù)后腹腔注射13 mL溫生理鹽水補(bǔ)充體液。假手術(shù)組除栓線(xiàn)10 min但不阻斷血流外其余操作相同。

1.3 模型成功標(biāo)準(zhǔn)：鏈脲佐菌素給藥7 d后非空腹血糖＞13.8 mmol/L且體質(zhì)量＞250 g為糖尿病大鼠建模成功。造模術(shù)后6 h行改良Bederson神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分1～3分的大鼠提示造模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨機(jī)選取8只大鼠為空白組。除外造模過(guò)程中死亡及造模不成功的大鼠后將剩余40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組、針康組等5組，每組各8只。

1.5 干預(yù)方法針刺組：造模24 h后予以頭穴叢刺及背俞穴針刺，在百會(huì)穴及其兩側(cè)旁開(kāi)4 mm處向前平刺至頂前區(qū)刺入深度0.5寸（150次/分），捻轉(zhuǎn)1 min后留針1 h，2次/天。康復(fù)組：成模24 h后予以跑臺(tái)訓(xùn)練，每日1次，每次20 min，速度逐步增加：前3 d 5 m/min，4～7 d 10 m/min，14～21 d 15 m/min。針康組予以上述2種干預(yù)措施。

1.6 按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)（Imageproplus6.0）對(duì)大鼠骨骼肌NF-κB-p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行分析；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR流程進(jìn)行操作，得出各組大鼠骨骼肌PI3KmRNA、IRS-1mRNA表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法：采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠骨骼肌NF-кB-p65表達(dá)比較：與假手術(shù)組（7064.75±347.44）及模型組（7193.43±380.28）相比，針刺組（6359.63±367.40）、康復(fù)組（5997.44±206.20）、針康組（5611.26±446.48）NF-кB-p65光密度值均顯著降低（P＜0.05）；與針刺組比較及康復(fù)組相比，針康組光密度值明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠骨骼肌IRS-1mRNA、PI3KmRNA表達(dá)比較：與假手術(shù)組及模型組相比，干預(yù)組IRS-1mRNA與PI3K mRNA表達(dá)量均顯著增加（P＜0.05），且與針刺組及康復(fù)組相比，針康組表達(dá)量增加更為顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖1、2。

3 討 論

糖尿病腦卒中已成為糖尿病最重要的致殘?jiān)蛑唬瑢?duì)人類(lèi)健康造成極大威脅。本研究通過(guò)建立穩(wěn)定且可靠的糖尿病大鼠模型，在此基礎(chǔ)上建立腦卒中模型，能夠很好地模擬臨床糖尿病患者的病理生理過(guò)程。針康法是結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)針刺療法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)的一種新型治療方案，能夠幫助腦血管意外患者快速康復(fù)，臨床應(yīng)用效果顯著。

眾多臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)，針刺療法能有效改善腦卒中引起的肢體偏癱并促進(jìn)肢體神經(jīng)功能恢復(fù)，頭穴叢刺法是于致順教授結(jié)合豐富臨床經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)研究的基礎(chǔ)上提出“頭部透穴治療腦血管病后癱瘓”的論點(diǎn)。該論點(diǎn)認(rèn)為頭穴叢刺法采取透經(jīng)、透穴的理念，可以起到一經(jīng)帶多經(jīng)以及一穴帶多穴的作用。于教授認(rèn)為[5]針刺頭部區(qū)域可以產(chǎn)生一種“針場(chǎng)”，循經(jīng)絡(luò)傳送至大腦皮質(zhì)，對(duì)大腦皮質(zhì)有明顯刺激作用，進(jìn)而改善腦神經(jīng)細(xì)胞興奮性，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

圖1 各組大鼠骨骼肌IRS-1mRNA表達(dá)

圖2 2 各組大鼠骨骼肌PI3KmRNA表達(dá)

NF-кB信號(hào)通路是胰島素抵抗和炎性反應(yīng)過(guò)程中的重要一環(huán)，NF-кB活化后可以調(diào)節(jié)下游炎性因子的轉(zhuǎn)錄（如TNF-α、IL-1?、IL-6等），而表達(dá)的炎性因子又正反饋使NF-кB進(jìn)一步活化，形成“炎癥瀑布效應(yīng)”；研究發(fā)現(xiàn)[6]，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過(guò)IRS/PI3K途徑進(jìn)行，若機(jī)體處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，IRS/PI3K信號(hào)通過(guò)傳導(dǎo)效率下降。本研究結(jié)果表明：與模型組相比，各干預(yù)組NF-кB-p65光密度值均明顯降低（P＜0.05）；針康組光密度值較針刺組及康復(fù)組降低（P＜0.05），提示針康法可以降低骨骼肌的NF-κB表達(dá)，進(jìn)而緩解由于高血糖引起的慢性炎癥狀態(tài)，改善骨骼肌胰島素抵抗。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)針康組大鼠骨骼肌中IRS-1mRNA與PI3KmRNA的表達(dá)量較針刺組和康復(fù)組均明顯增加，表明針康法能夠有效促進(jìn)IRS/PI3K信號(hào)通路活化，從而表達(dá)更多IRS-1mRNA、PI3KmRNA以增強(qiáng)骨骼肌胰島素敏感性，而這一作用可能與NF-кB信號(hào)通路受抑制密切相關(guān)。

綜上所述，針康法可能通過(guò)抑制糖尿病腦卒中大鼠骨骼肌NF-кB信號(hào)通路來(lái)增加骨骼肌IRS-1mRNA、PI3KmRNA的表達(dá)，從而改善骨骼肌炎癥狀態(tài)及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，為今后的臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。