循環(huán)微粒水平對急性呼吸窘迫綜合征的預(yù)后價值

葛文品 戚 迪 王導(dǎo)新 何 婧 趙 燕 鄧 旺 朱 濤

（1 重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404120；2 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400010）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是以彌漫性肺泡-毛細(xì)血管膜損傷和非心源性肺水腫為病理特征，以頑固性低氧血癥和呼吸窘迫為特征性表現(xiàn)的臨床常見呼吸危重癥，重度ARDS病死率仍高達(dá)46%[1]。ARDS作為一種存在明顯異質(zhì)性的綜合征，目前針對其有效臨床干預(yù)手段主要集中于肺保護(hù)性通氣和避免液體過負(fù)荷等支持治療，尚未證明ARDS藥物治療能夠降低近期或遠(yuǎn)期病死率，故而在個體化精準(zhǔn)治療時代，仍需更多創(chuàng)新性研究優(yōu)化臨床治療方案，降低ARDS患者病死率[2]。循環(huán)微粒（microparticles，MP）是細(xì)胞活化、損傷、凋亡時，由細(xì)胞釋放的具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，是機體面對急性應(yīng)急刺激時的內(nèi)源性產(chǎn)物。本研究主要探討循環(huán)MP水平對急性呼吸窘迫綜合征患者預(yù)后評估的臨床價值。

表1 兩組ARDS患者一般資料比較

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2017年2月至2018年2月，重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院（16例）及重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（22例）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科加強治療病房（Respiratory Intensive Care Unit，RICU）收治的共38例ARDS患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2012年由歐洲危重病醫(yī)學(xué)會（European Society of Intensive Care Medicine，ESICM）與美國胸科學(xué)會（American Thoracic Society，ATS）聯(lián)合委員發(fā)布的柏林定義[4]：①起病時間：從已知臨床損害或新發(fā)或原有呼吸系統(tǒng)癥狀加重后7 d內(nèi)；②胸部影像學(xué)：X線或CT掃描示雙肺浸潤影，不能用胸腔積液、肺葉塌陷或結(jié)節(jié)完全解釋；③肺水腫原因：無法用心力衰竭或體液超負(fù)荷完全解釋的呼吸衰竭，如無相關(guān)危險因素，需要進(jìn)行客觀評估（例如超聲心動圖）以排除靜水壓增高型肺水腫。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡未滿18歲；②妊娠；③已經(jīng)確定或高度懷疑惡性腫瘤；④接受免疫抑制劑治療；⑤胸壁手術(shù)或創(chuàng)傷。同時連續(xù)分層隨機納入38名健康受試者作為對照組。本研究通過重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批，并征得患者及家屬同意并簽署知情同意書后進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集：收集并記錄納入患者人口學(xué)資料及相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、肱動脈血壓、急性生理及慢性健康評分Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）、合并癥、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、空腹血糖、血脂、血常規(guī)、肝腎功、ARDS病因、并發(fā)癥、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C反應(yīng)蛋白（C-Reactive protein，CRP）等，同時記錄ARDS患者診斷確立時氧合指數(shù)（PaO2/FiO2），并根據(jù)柏林定義將患者分為輕度（n=20）：呼吸末正壓（PEEP）或持續(xù)氣道正壓（CPAP）≥5 cm H2O，200 mm Hg＜ PaO2/FiO2≤300 mm Hg）；中度（n=9）：（PEEP≥5 cm H2O時，100 mm Hg＜ PaO2/FiO2≤200 mm Hg）；重度（n=9）：（PEEP≥5 cm H2O時，PaO2/FiO2≤100 mm Hg）；（1 cm H2O=0.1kPa，1 mm Hg=0.133 kPa）。依據(jù)入院28 d存活情況分為生存組（n=21）和死亡組（n=18）。

1.2.2 標(biāo)本收集：ARDS診斷確立后24 h內(nèi)，采用金黃色分離膠管采集患者空腹外周靜脈血5 mL，翻轉(zhuǎn)后靜置30 min以上至血液凝集完全，3000 r/min 4 ℃離心15 min（離心半徑8 cm），收集上層血清，1.5 mL EP管分裝后，凍存于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)待后續(xù)相關(guān)檢測。

1.2.3 循環(huán)微粒水平檢測：差速離心法收集循環(huán)微粒，循環(huán)微粒捕獲法（microparticle capture）檢測循環(huán)微粒總數(shù)。1500×g 4 ℃離心15 min（離心半徑8 cm），棄細(xì)胞沉渣，收集上清后，再次13000×g 4 ℃離心2 min，收集上清。以稀釋液稀釋上清液后，加至包被有鏈霉素及生物素標(biāo)記Annexin V（一種膜聯(lián)蛋白）的微量滴定板內(nèi)，37 ℃孵育1 h。洗板后，依次加入顯色劑及底物，37 ℃孵育10min顯色，2%枸櫞酸終止顯色。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測定405 nm波長各孔的吸光度（OD值）。將MPs定義為直徑＜1 μm，且Annexin V陽性。以稀釋液為陰性對照。

1.2.4 研究終點：以ARDS患者28 d死亡或生存情況作為主要終點。患者機械通氣時間、RICU入住時間、總住院時間作為次要研究終點。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法：統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0軟件，作圖采用GraphPad Prism 5.0軟件。對于服從正態(tài)分布的連續(xù)性變量，如年齡、BMI、平均動脈壓、循環(huán)微粒數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、PCT、CRP，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用t檢驗行兩組間比較，單因素方差分析行三組間比較；對于服從偏態(tài)分布的連續(xù)性變量，如APACHEⅡ評分、PaO2/FiO2、機械通氣時間、總住院時間，結(jié)果以中位數(shù)（四分位間距）表示，應(yīng)用曼-惠特尼U檢驗行兩組間比較；對于計數(shù)資料，結(jié)果以例數(shù)（%）表示，費舍爾精準(zhǔn)檢驗行兩組間比較。正態(tài)分布的連續(xù)性變量資料采用皮爾森相關(guān)分析，偏態(tài)分布的連續(xù)性變量資料采用史匹曼等級分析探討循環(huán)微粒水平與ARDS患者各臨床指標(biāo)相關(guān)性。使用邏輯回歸確定預(yù)后指標(biāo)的獨立預(yù)測因素。采用受試者工作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）分別評估循環(huán)微粒數(shù)水平ARDS 28 d病死率的預(yù)測值、敏感度和特異度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARDS患者人口學(xué)及臨床特點：兩組間患者性別、年齡、病因等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，資料均衡、可比。與生存組比較，死亡組APACHEⅡ評分、PCT水平更高，氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）則相對更低。肺部感染為本研究ARDS患者的最常見病因。與生存組比較，死亡組總住院時間均顯著高于生存組，且更易伴發(fā)膿毒癥休克、急性腎功能衰竭等器官衰竭。見表1。

2.2 兩組ARDS患者循環(huán)微粒水平比較：ARDS患者死亡組循環(huán)微粒水平顯著低于生存組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（3.16±1.92）μmol/L，（5.80±2.06）μmol/L；t=4.04，P=0.00）]，如圖1A。輕度、中度、重度ARDS患者的循環(huán)微粒水平分別分為（6.08±2.45）μmol/L、（4.09±1.91）μmol/L，（2.81±1.96）μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.32，P=0.02）。其中重度ARDS患者的循環(huán)微粒水平顯著低于輕度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（2.81±1.96）μmol/L，（6.08±2.45）μmol/L；t=3.65，P=0.03]，見圖1B。

圖1 兩組急性呼吸窘迫綜合征患者循環(huán)微粒水平比較（*P＜0.05）

2.3 循環(huán)微粒水平與ARDS其他臨床預(yù)測指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性分析：循環(huán)微粒水平與及ARDS患者機械通氣時間呈顯著負(fù)相關(guān)（y=19.45-1.57x，F(xiàn)=66.59，P=0.000），與氧合指數(shù)呈顯著正相關(guān)（y=44.25+40.76x，F(xiàn)=74.37，P=0.000），但與APACHE Ⅱ評分、PCT、CRP、總住院時間未見顯著相關(guān)性，見圖2。

圖2 急性呼吸窘迫綜合征患者循環(huán)微粒水平與機械通氣時間及氧合指數(shù)的相關(guān)性分析

2.4 循環(huán)微粒數(shù)對ARDS 28 d病死率的預(yù)測能力評價：多因素logistic回歸分析結(jié)果示，MP和APACHEⅡ評分2個自變量的回歸系數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P=0.017，P=0.016），回歸方程為：LogitPi=-0.83-1.13×MP+0.62×APACHE Ⅱ，見表2。循環(huán)微粒水平預(yù)測ARDS 28d病死率的受試者曲線下面積（AUC）為0.82[95%CI：0.680～0.958]，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），說明循環(huán)微粒水平對ARDS 28d病死率有預(yù)測價值，見圖3。根據(jù)約登指數(shù)篩選最優(yōu)截點結(jié)果示，循環(huán)微粒數(shù)為3.28 μmol/L以下時，ARDS 28 d病死率明顯升高，預(yù)測ARDS 28 d病死率的敏感度為59.0%，特異度為95.0%。

表2 急性呼吸窘迫綜合征患者28 d病死的獨立預(yù)測因素分析

圖3 循環(huán)微粒水平預(yù)測急性呼吸窘迫綜合征患者28 d病死率的ROC曲線

3 討 論

循環(huán)MP是細(xì)胞活化、損傷、凋亡時，由細(xì)胞釋放的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，直徑為100～1000nm，根據(jù)其大小、內(nèi)容物組成、生物發(fā)生機制可進(jìn)一步劃分為外泌體、微粒和凋亡小體[3-4]。正常狀態(tài)下，健康成人血液中即存在少量細(xì)胞微粒，參與凝血、炎性反應(yīng)等生物過程，包括凝膠溶素、氨磷脂移位酶、翻轉(zhuǎn)酶、磷脂混雜酶和鈣蛋白酶的多種酶可參與細(xì)胞膜磷脂不對稱性的穩(wěn)態(tài)維持。當(dāng)細(xì)胞活化、凋亡、損傷時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子增多，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的升高導(dǎo)致凝膠溶素、磷脂混雜酶、鈣蛋白酶的活化，同時抑制氨磷脂移位酶的活化，打破細(xì)胞膜磷脂不對稱性的穩(wěn)態(tài)平衡，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外層，并伴隨細(xì)胞骨架重構(gòu)，以出芽方式，包裹起源細(xì)胞的microRNA（微小RNA）、mRNA、線粒體DNA、脂質(zhì)、蛋白等成分形成微粒，脫落、釋放至外周循環(huán)血液中，成為循環(huán)微粒[5]。由于釋放入循環(huán)外周血的微粒可攜帶供體細(xì)胞的特異細(xì)胞質(zhì)成分，且能隨外周血液循環(huán)至遠(yuǎn)隔靶器官實現(xiàn)長距離信號傳遞，故而形成一種重要的細(xì)胞間物質(zhì)傳遞、信息傳導(dǎo)系統(tǒng)，對機體組織間穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮至關(guān)重要的作用[6-7]。目前可以確認(rèn)微粒廣泛參與心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤的病理生理過程，與冠狀動脈粥樣硬化、靜脈血栓栓塞癥、糖尿病微血管病變等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)的研究熱點[8-10]。

近年來越來越多的研究揭示微粒在包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺間質(zhì)疾病、肺癌等多種肺臟疾病扮演重要角色。但目前，其與ARDS的研究尚處于初步探索階段[11]。正常情況下，健康成人外周循環(huán)血液中即存在少量細(xì)胞微粒，參與凝血、炎癥等生理反應(yīng)。由于微粒及其內(nèi)容物對感染、缺氧、氧化應(yīng)激等非常敏感，組織受損情況下，相關(guān)細(xì)胞激活或凋亡加速，循環(huán)中細(xì)胞微粒水平、內(nèi)容物成分及來源比例均會迅速發(fā)生特異性改變。前期研究通過比對ARDS患者機械通氣患者、非肺部疾病機械通氣患者及自主呼吸患者的肺支氣管肺泡灌洗液（BALF）及動脈血漿中不同細(xì)胞來源的MP，發(fā)現(xiàn)ARDS患者BALF中白細(xì)胞來源微粒（LeuMP）和粒中性粒細(xì)胞來源微粒（NeuMP）與對照組相比顯著提高。亞組分析進(jìn)一步比對ARDS發(fā)病第1天的外周循環(huán)血，發(fā)現(xiàn)生存組循環(huán)LeuMP、血小板來源微粒（PMP）水平較死亡組顯著升高；免于機械通氣天數(shù)＞5 d的亞組患者循環(huán)LeuMP、PMP水平較免于機械通氣天數(shù)＜5 d的亞組患者水平顯著升高；循環(huán)LeuMP ＞60 elements/μL與ARDS患者28 d生存率提高相關(guān)。其原因或許為循環(huán)中MP不僅有具有抗炎保護(hù)效應(yīng)，還對血管低張力導(dǎo)致的微循環(huán)障礙有改善效應(yīng)[12]。但研究還發(fā)現(xiàn)，與心源性肺水腫患者相比，ARDS患者肺水腫液中細(xì)胞微粒水平顯著升高，且這些微粒中因富含組織因子表現(xiàn)出更高的促凝活性。亞組分析提示，生存組患者肺泡灌洗液中微粒濃度顯著低于死亡組，這可能有賴于微粒在激活凝血系統(tǒng)中的重要作用，使得肺泡纖維素沉積增多，不利于氧合[13]。但目前，微粒與ARDS的相關(guān)研究甚少，故而亟待更多深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)死亡組ARDS患者循環(huán)微粒水平顯著低于生存組，結(jié)合前期研究報道，提示低水平的循環(huán)微粒往往反映機體免疫抑制狀態(tài)，應(yīng)對急性應(yīng)激損傷時囊泡形成障礙，因而低水平微粒的ARDS患者更易合并感染、多器官衰竭，故預(yù)后更差，病死率更高。

本研究尚存在以下不足：微粒根據(jù)細(xì)胞來源可進(jìn)一步分為內(nèi)皮細(xì)胞微粒、血小板微粒、白細(xì)胞微粒及滋養(yǎng)層微粒等，并攜帶特異性組分，表達(dá)不同的表面標(biāo)記蛋白。本研究樣本量較小，未對循環(huán)微粒的細(xì)胞來源及內(nèi)容物組分進(jìn)行具體分析。其次，未對ARDS不同預(yù)后患者入院后循環(huán)微粒水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和分析。隨著生物技術(shù)的革新突破和疾病異質(zhì)性的認(rèn)識深化，在今后的研究中，我們將進(jìn)一步探究不同細(xì)胞來源的微粒在ARDS整個病程中扮演的不同角色，及其可能涉及的具體分子生物學(xué)機制，以期為基于細(xì)胞微粒的ARDS精準(zhǔn)醫(yī)療提高理論基礎(chǔ)。綜上結(jié)果提示，ARDS患者急性期循環(huán)微粒水平顯著提高，其水平與ARDS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后顯著相關(guān)。