三種冷凍方法對胎兒卵巢組織凋亡相關蛋白表達的Bcl-2、Bax、Caspase影響

王國平 李倩倩 王燕蓉

（1 寧夏醫科大學組織學與胚胎學教研室，寧夏回族自治區生殖與遺傳重點實驗室，寧夏 銀川 750004；2 寧夏銀川市婦幼保健院，寧夏 銀川 750001；3 寧夏醫科大學附屬總院消化內科，寧夏 銀川 750004）

目前凍存卵巢組織的冷凍方法有程序冷凍法、快速冷凍法、玻璃化冷凍法，三種方法是否存在低溫誘導卵泡凋亡，Bcl-2家族是否在低溫誘導卵泡凋亡中發揮調控作用，目前國內尚未見報道。為觀察不同冷凍方法所致凋亡程度的大小，本研究觀察了Bcl-2、Bax及Caspase-3在冷凍后的卵巢內早期卵泡的表達，并以此作為卵巢凍存后損傷程度的檢測方法，評價不同冷凍方案的冷凍效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胎兒卵巢的獲取：本研究獲醫學倫理委員會同意。征得家屬同意，胎兒卵巢取自20～28周引產的死亡女胎，將卵巢皮質切成2 mm×2 mm×1 mm大小的皮質塊備用。

1.1.2 卵巢凍存實驗分組：①新鮮對照組（fresh control group，FCG）；②程序法冷凍組（program freezing group，PFG）；③快速法冷凍組（rapid freezing group，RFG）；④玻璃化法冷凍組（vitrification group，VG）。

1.1.3 實驗用液體：①冷凍保護液：A組液體（用于程序冷凍法和快速冷凍法）；B組液體（用于玻璃化冷凍法）。②解凍液：A組液體（用于程序冷凍法和快速冷凍法）；B組液體（用于玻璃化冷凍法）。

1.2 方法

1.2.1 冷凍及解凍方法：①程序冷凍法：冷凍程式參照Oktay等提出的慢凍-速融方法[1]。②快速冷凍法：采用本實驗室摸索出的程序進行[2]。③程序冷凍法與快速冷凍法的解凍方法 參照Shaw氏法[3]。④玻璃化冷凍、解凍法：采用本實驗室摸索出的程序進行[4]。

1.2.2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 免疫組織化學檢測：一抗為兔抗人Bcl-2/Bax/Caspase-3單克隆抗體，二抗為山羊抗兔IgG。采用免疫組化SABC法，陰性對照以PBS 代替一抗。操作步驟嚴格按說明書進行。

1.3 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白陽性表達卵泡判斷標準：高倍視野下，卵細胞胞質內出現棕色顆粒或≥2個顆粒細胞出現棕色顆粒，視為Bcl-2、Bax或Caspase-3蛋白陽性表達卵泡，每張切片隨機取5個高倍視野，計數陽性卵泡數量和總卵泡數，得出Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白陽性表達卵泡百分率。

1.4 統計學方法：用SPSS 11.0進行統計學處理，各指標數值均采用均數±標準差表示（），Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白陽性表達卵泡百分率比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bcl-2、Bax蛋白表達：新鮮組及冷凍各組Bcl-2、Bax蛋白主要在始基卵泡內的卵母細胞胞質中呈不同程度表達，偶見卵泡細胞表達。新鮮組、玻璃化冷凍組Bcl-2/Bax比值＞1；程序冷凍組、快速冷凍組Bcl-2/Bax比值＜1。

2.1.1 Bcl-2蛋白表達：三種方法冷凍后卵泡內Bcl-2蛋白陽性表達率較冷凍前下降，與新鮮組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.1.2 Bax蛋白表達：凍后卵泡內Bax蛋白陽性表達率顯著上升，快速冷凍組Bax蛋白陽性表達率顯著高于新鮮組，P＜0.001。程序冷凍組、玻璃化冷凍組雖高于新鮮組，但無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 Caspase-3蛋白表達：新鮮組及冷凍各組Caspase-3蛋白主要在始基卵泡內的卵泡細胞胞質中呈不同程度表達，凍后卵泡內Caspase-3蛋白陽性表達率上升，除玻璃化冷凍組與新鮮組無顯著性差異外（P＞0.05），其他兩個冷凍組與新鮮組均有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

表1 各組卵泡冷凍前后蛋白陽性表達率的變化（）

表1 各組卵泡冷凍前后蛋白陽性表達率的變化（）

注：*：與其他組相比，P＜0.01；**：與其他組相比，P＜0.001；***：與其他組相比，P＜0.001；▲：與PFG組相比，P＜0.05

3 討 論

卵巢內細胞凋亡是一種受各種機制調控的程序化細胞死亡。越來越多的研究顯示，在卵泡的凋亡調控中，以Bcl-2蛋白家族為代表的一組凋亡調節蛋白起著極為重要的作用。本研究結果顯示：冷凍后的Bax 蛋白表達較冷凍前明顯上升，Bcl-2蛋白表達在卵巢冷凍后則顯著下降，且Bax、Bcl-2表達趨勢與Caspase-3表達相一致，即隨Bcl-2表達降低，Bax表達升高，Caspase-3表達也增加，表明冷凍過程影響了細胞凋亡過程。劉子明等認為若Bcl-2/ Bax 比值＞1，細胞趨于存活；反之若Bcl-2/ Bax 比值＜1，則細胞趨向發生凋亡[5]。本研究發現：強表達Bax蛋白的PFG組、RFG組早期卵泡，Bcl-2蛋白弱表達或者不表達；反之，Bcl-2蛋白強表達的VG組早期卵泡，Bax蛋白弱表達或者不表達。統計結果顯示：PFG組、RFG組 Bcl-2/ Bax 比值＜1，Caspase-3表達陽性率高，單位體積卵巢皮質塊所保存的卵泡數少，而Bcl-2/ Bax比值＞1的VG組，Caspase-3表達陽性率低，單位體積卵巢皮質塊所保存的卵泡數多。這在一定程度上也證實VG組的冷凍效果好于PFG組與RFG組，與組織形態學觀察結果相一致[6]。分析原因可能是方法欠佳的凍存由于保護劑的毒性作用或冰晶的破壞導致細胞Bcl-2、Bax的表達失常，Bcl-2的表達下降，Bax的表達增強導致卵泡凋亡過程的啟動，活化了Caspase-3，細胞發生凋亡。

另有研究顯示：冷凍復溫的過程主要破壞卵泡中的顆粒細胞，而對卵母細胞的損傷很小[7]。其原因可能與卵母細胞位于卵泡的中間，代謝低，細胞器少，缺乏皮質顆粒，周圍有顆粒細胞的保護，所以容易存活。而顆粒細胞位于卵泡的外層，最早接觸冷凍保護劑以及感受外界環境的變化，損傷較卵母細胞嚴重[8]。顆粒細胞具有重要的作用，其增殖與分化既是始基卵泡啟動的重要前提，又為生長期卵泡的進一步發育成熟提供必要的營養與信息支持。在我們的實驗中發現，Bcl-2、Bax均在卵母細胞胞質內表達，而Caspase-3則在顆粒細胞上表達。我們推測深低溫冷凍可能是通過上調Bax基因的表達，下調Bcl-2基因的表達，通過線粒體介導的細胞內途徑最終導致顆粒細胞內Caspase-3活化，最終使胎兒卵巢內早期卵泡通過細胞內凋亡途徑趨向死亡。

綜上所述，玻璃化凍存法可有效凍存胎兒卵巢組織。不同冷凍方法均導致了Bcl-2表達的下降和Bax及Caspase-3表達的增加，冷凍所誘導的卵泡凋亡參與了卵泡的后續丟失。

研究凍存和融解過程中細胞損傷機制，對卵泡在冷凍損傷中的凋亡事件進行探討，可以透過微細構造變化的觀察找出卵巢經冷凍保存系列步驟中可能造成傷害的原因，并判斷冷凍保存過程中細胞受損傷狀況，若能進一步找出減輕或解決損傷的方法，將有助于提高卵巢深低溫保存的存活率。