石菖蒲水提取物對人腦神經膠質細胞NO 表達的影響

楊海淦 曹 蕊 王茂杰 陳育忠

1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院胃腸外科，廣東廣州 510000；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院重癥醫學科，廣東廣州 510000；3.廣東省中醫院風濕科，廣東廣州 510000

神經膠質細胞簡稱膠質細胞是中樞神經系統（CNS）的重要組成部分，約占90%[1]。自Pfrieger 等[2]1997 年首次報道膠質細胞能促進神經元間的突觸聯系后，膠質細胞的作用越來越引起神經科學研究者的重視。

一氧化氮（NO）是一種非經典神經遞質、細胞功能調節因子，在中樞神經系統中廣泛分布，參與膠質細胞各種生理及病理狀態的調控，是細胞間信息交換的重要介質。NO 根據所處氧化狀態的不同，可發揮神經保護或神經毒性作用[3-7]。NO 在低濃度時對細胞有保護作用，而在高濃度時則可產生細胞毒性作用[8]。

歷代本草中，普遍認為石菖蒲性味辛、苦、溫，入心、胃經，能豁痰開竅、化濕和胃、醒神益智，是芳香寧神、滌痰開竅之要藥。臨床上常用于熱病神昏、癲狂、痰厥、健忘、阿爾茨海默病等疾病的治療。研究[9]發現，石菖蒲具有良好的腦細胞保護作用，能增加小鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低腦內過氧化脂質（LPO）水平。然而，相關研究僅僅局限于石菖蒲有效成分的藥理作用上，并未從免疫生化以及分子遺傳等方面進行探討。為了進一步從分子生化方面探討石菖蒲作用的相關機制，筆者設計了本實驗，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

人腦神經膠質細胞（HEB，中山大學細胞動物實驗中心）；細胞培養基（DMEM）、胎牛血清（Gibco 公司）；0.25% 供應胰酶（Trypsin-EDTA）（1×）（GIBCO）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）PH 7.2 basic（1×）（GENOM）；石菖蒲飲片（康華藥業）；四甲基偶氮唑鹽比色試劑（MTT）（廣州妙博生物技術有限公司）；NO（碧云天生物技術）；倒置顯微鏡（NIKON TE300）；二氧化碳培養箱（HSO301T-VBA）；真空冷凍干燥機（Christ Alpha2-4LSC-Plus）、旋轉蒸發儀（RV 10basic V）。

1.2 石菖蒲凍干粉的制作

將100 g 石菖蒲飲片高速粉碎后轉移到圓底燒瓶中，加1000 mL 的超純水，于電熱套上加熱，猛火燒沸后調至溫火繼續煮1 h，收集第一遍的水提液；再加400 mL 超純水至藥渣中繼續第二次煎煮，時間火候同第1 次，后將2 次收集的水提液混合；將收集的水提液離心2 次（3000 r/min，5 min），收集上清液，轉移到圓底燒瓶中，置于旋轉蒸發儀上進行濃縮，最終濃縮液量約為100 mL，即藥物濃度為1 g/mL。

將濃縮液分裝于培養皿中，用保鮮膜封好，置于-80℃冰箱過夜。隔日放于冷凍干燥機冷凍干燥24 h。干燥后將凍干粉轉移到離心管中，稱量后分裝保存。使用前先用細胞培養基（含10%胎牛血清）配成濃度為1 mg/mL 的母液。

1.3 細胞培養

將HEB 置于37℃5% CO2的二氧化碳培養箱培養。細胞傳代時將舊的細胞培養液去掉，加2 mL PBS洗2 次，去掉PBS，再加1 mL 胰酶進行消化，時間大約1 min，迅速去掉胰酶，加入3 mL 完全培養基終止消化，后進行吹打，使細胞剝落，充分吹勻后平均分到2 個75 mm2的培養瓶中，再向培養瓶中加入5 mL完成培養基，擰好蓋子后放回培養箱中培養。

1.4 MTT 檢測細胞活性

細胞以每孔3000 個細胞種于96 孔板種，待細胞貼壁后棄去培養液，分成對照組（磷酸鹽緩沖液0 μg/L）、石菖蒲水提取物組，分別加入37.5、75、150、300、600、1000 μg/L 的石菖蒲水提取物。放回培養箱繼續培養不同時間（24、36、48 h）。每隔12 h 取1 個96 孔板進行實驗，避光，每孔加20 μL MTT 試劑（5 mg/mL），放回培養箱中孵育4 h。孵育完成后用一次性無菌注射器（1 mL）貼壁慢慢吸走含MTT 的培養液，再每孔加入150 mL 的DMSO，于多微孔板震蕩器上震蕩10 min。在酶標儀上使用570 nm 波長檢測OD 值，保存數據。

1.5 檢測NO 的表達

以每孔10 萬個細胞數種24 孔板，待細胞貼壁后棄去培養液，加用不同濃度的LPS（0、10、100、1000、10 000、20 000 ng/mL）放回培養箱繼續培養24 h，取上清液進行實驗。確定LPS 濃液后，進一步將實驗分成對照組（磷酸鹽緩沖液組）、石菖蒲37.5 μg/mL 組、石菖蒲75 μg/mL 組、石菖蒲150 μg/mL 組、石菖蒲300 μg/mL組、石菖蒲600 μg/mL 組。培養2 h 后加用LPS（1 μg/mL），放回培養箱繼續培養22 h，取上清液進行實驗。取出NO 試劑盒的Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，使回復室溫。用DMEM+10%FBS 稀釋標準品（1～100 μmol/L），使其梯度為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL/孔，在96 孔板中加入標準品及培養液上清。按50 μL/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent Ⅰ以及Griess Reagent Ⅱ，最后在酶標儀上使用540 nm 波長檢測OD 值，保存記錄數據。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 石菖蒲水提取物藥物濃度選擇

MTT 結果提示石菖蒲水提取物對HEB 細胞活性具有顯著抑制作用（P ＜0.05），且呈濃度和時間依賴性。而1000 μg/mL 濃度的石菖蒲水提取物出現明顯抑制細胞活性，考慮與藥物濃度過大出現細胞毒性作用。見表1。故后續實驗僅選0～600 μg/mL 的濃度范圍。

2.2 不同濃度LPS 對HEB 誘導的NO 表達的影響

在加用LPS 后可發現當濃度≥100 ng/mL 時即可明顯誘發HEB 產生大量NO，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），而且隨著藥物濃度的不斷升高，其效應更加明顯，提示LPS（100 ng/mL）可成功誘導HEB 的病理模型。見表2。

表1 不同濃度石菖蒲水提取物不同作用時間對細胞活性平均抑制率的比較（±s，n=3）

表1 不同濃度石菖蒲水提取物不同作用時間對細胞活性平均抑制率的比較（±s，n=3）

注：與對照組（0 μg/mL）比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，#P ＜0.001

表2 不同濃度LPS 對HEB 誘導NO 表達的影響

2.3 不同濃度石菖蒲水提取物對LPS 誘導的HEB NO 的表達的影響

在LPS 誘導的HEB 病理模型上，加用石菖蒲水提取物后可明顯抑制NO 的表達。在低濃度37.5 μg/mL即可明顯抑制由LPS 1 μg/mL 所誘導的NO 高表達。隨著藥物濃度升高，其抑制作用明顯增強，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表3。

表3 不同濃度石菖蒲水提取物對LPS 誘導的HEB NO 表達的影響（n=3）

3 討論

既往對石菖蒲的藥理研究主要集中在揮發油、水煎液、水提醇沉液對中樞神經系統的作用上，普遍認為石菖蒲揮發油具有中樞鎮靜、催眠、抗驚厥作用[10-14]。如早在1982 年，金維岳[15]經過相關臨床研究后提出，用單味石菖蒲揮發油制成的注射液（0.5%總揮發油溶液）治療肺性腦病昏迷，能迅速消除意識障礙和神經精神癥狀，有效率高達74.97%。此外，石菖蒲能促進正常小鼠學習記憶和記憶獲得[16]。21 世紀，方永奇等[17]研究石菖蒲醒腦開竅作用的物質基礎及其作用機制研究，提出石菖蒲醒腦開竅和保護神經細胞的有效部位主要是揮發油和β-細辛醚。故無論是中國歷史文獻資料還或現代臨床及機制研究結果都表明石菖蒲對大腦的正常功能發揮起到促進作用。然而，本研究發現石菖蒲水提取物對神經膠質細胞的活性并無明顯作用，考慮可能與其正性作用僅僅體現在對中樞神經系統即神經元的影響上，而對周圍神經系統如神經膠質細胞等的功能并無明顯的促進作用。

NO 是由L-精氨酸（LArg）和分子氧為底物，在一氧化氮合成酶（NOS）的催化和還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四氫生物喋呤（BH4）等因子輔助下，使L-精氨酸的胍基氮原子被氧化而成的[18]。神經膠質細胞中的NOS 為誘導型一氧化氮合酶，在細胞因子、內毒素以及某些內源性異常蛋白的作用下，星形膠質細胞、小膠質細胞可產生大量的NO，為病理型[19-20]。本研究發現石菖蒲可明顯抑制LPS 誘導的HFB 中NO 的濃度，推測很有可能石菖蒲提取物是通過直接抑制誘導型NOS 的活性或影響神經膠質細胞內L-精氨酸或分子氧兩種底物的濃度，或iNOS催化過程中所需要的各種輔助因子的合成過程有關。故而進一步闡明石菖蒲提取物對病理型NO 的生成過程各種因子及催化酶的影響將成為我們今后努力的方向之一。另外，本研究還發現石菖蒲提取物對未誘導的正常HEB 并沒有抑制作用，而且MTT 結果也提示其對細胞活性無明顯影響，這可能與HEB 在被誘導活化后某基因的異常表達有關。