PI3K 及p-Smad7 的表達對骨肉瘤細胞增殖的影響

張小平 于 哲 胥 云 閆 康 廖 博 周 勇 高銅拴

解放軍空軍軍醫大學唐都醫院全軍骨腫瘤研究所，陜西西安 710032

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，多見于兒童和青少年，好發于血運豐富的長骨干骺端，具有惡性程度高、轉移發生早、病情進展迅速且病死率高等特點，臨床治療的失敗率和死亡率較高[1]。骨肉瘤是極為難治的骨科腫瘤，其高轉移和侵襲性導致炎癥浸潤和淋巴結轉移。骨肉瘤的發生、發展是個復雜的過程，其中炎性因子的浸潤、成纖維細胞的激活、MAKP 信號通路的活化等，都促進其增殖和轉移能力[2]。研究表明，PI3K/p-Smad7 信號通路在胃癌、結腸癌和肝癌等腫瘤組織中，可以促進腫瘤細胞增殖和侵襲作用[3-4]。PI3K/p-Smad7 可以激活腫瘤上皮細胞間質轉型的發生，同時促進腫瘤干細胞的激活和轉化，有文獻分別報道了PI3K 在骨肉瘤中的促癌作用和p-Smad7 對骨肉瘤的高轉移和侵襲性影響[5]。但是PI3K 和p-Smad7 聯合形成的分子信號通路間的相互作用和相關性，以及兩者對骨肉瘤增殖作用影響尚不完全明確。因此，本研究采用骨肉瘤患者癌組織和骨肉瘤細胞系MG-63，探討PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤中的表達及其作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017 年1 月～2018 年10 月解放軍空軍軍醫大學唐都醫院（以下簡稱“我院”）骨科收治的60 例骨肉瘤患者（骨肉瘤組織）和同期60 例軟骨組織（正常組織）為研究對象。納入標準：首次就診，且經我院病理檢驗科診斷證實，均未經任何治療。排除標準：①患有嚴重傳染性疾病和血液傳染??；②依從性差，無法配合研究者；③合并嚴重感染、心腦血管疾病以及肝腎功能嚴重障礙者；④合并其他骨病或系統性疾病。本研究方法和目的均告知患者和家屬，并簽署知情同意書，研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 材料

骨肉瘤細胞系MG-63 購自中國科學院上海細胞庫；蛋白定量試劑盒（P503021-0500）、SDS 凝膠試劑盒（P0012A）、細胞裂解液（P0013）、結晶紫（P8470-25g）均購自上海吉瑪生物有限公司；DMEM（SH30021）、胎牛血清（SH30406）、胰蛋白酶消化液（SV30042）購自美國HyClone；青鏈霉素混合液（P1400）、4%多聚甲醛（P1110）、苯胺藍（28631-66-5）和蘇木精（C0107）均購自武漢依科有限公司；Actin（ab179467）、PI3K（ab32089）、p-Smad7（ab114358）和兔二抗（ab150077）購自英國Abcam。PrimeScriptTMRT 試劑盒（R0047A）和SYBR（RR1297）購自中國TaKaRa。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 石蠟切塊進行脫蠟和水化處理，抗原修復后滴加封閉液；1∶500 稀釋HGF 一抗孵育；孵育結束后用PBS 進行沖洗，加生物素標記的二抗進行孵育；PBS 再次沖洗，滴加鏈霉親和素-過氧化酶溶液孵育。次日DAB 顯色液顯色，蘇木精染液復染，中性樹脂膠固封；PBS 作為一抗陰性對照組，陽性細胞著色為棕黃色。

1.3.2 MTT 增殖實驗 調整MG-63 細胞數4×105個/孔，對照組細胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，37℃，5%CO2培養箱內培養24、48、72 h。培養結束后每孔加入20 μL 的MTT，37℃，5% CO2培養箱內培養避光孵育4 h，室溫于搖床震蕩10 min。酶標儀490 nm 波長測出同一時間點OD 值，用OD 值進行細胞增殖影響的分析。

1.3.3 克隆形成實驗 將對數生長期MG-63 細胞消化，調整密度為300 個/孔，對照組細胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，培養48 h 接種至6 孔板，每孔加2 mL 的10%胎牛血清DMEM 培養液。細胞接種5 d 后每孔各加500 μL 胎牛血清繼續培養。貼壁生長15 d 后，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結晶紫溶液染色15 min，PBS 輕輕沖洗細胞，室溫風干后計數多于50 個細胞的克隆。

1.3.4 qRT-PCR MG-63 細胞數4×105個/孔，對照組細胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，培養箱設定37℃、5%CO2培養細胞，36 h 后收集細胞，向細胞中加入1 mL Trizol試劑以提取總RNA，嚴格按照PrimeScriptTMRT 試劑盒的說明將RNA 逆轉錄成cDNA，隨后加引物和SYBR Green。PCR 反應條件：在95℃下進行40 個循環5 s，在95℃下變性10 s，在60℃下退火20 s，在72℃下延伸15 s。每個樣本提供3 個重復的孔。使用Actin 作為參考標準，使用2-ΔΔCt計算mRNA 的相對表達水平。引物序列如下，Actin：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；PI3K：5′-ATCCTTTCCCGCGACACCCGAT-3′，5′-TCCCAGGCGTAGACCAA-3′；p-Smad7：5′-AGCCAATT-TTAACTGAGGAGT-3′，5′-GGCAAGTTGATTGGAGG-GA-3′。

1.3.5 Western blot 調整MG-63 細胞數4×105個/孔，對照組細胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，培養箱設定37℃、5%CO2培養細胞，36 h 后收集細胞，PBS 洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速離心（13 000 r/min，離心半徑30 cm）吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE 電泳后進行轉膜操作，轉膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBST 清洗，均為1∶1000 稀釋Actin、PI3K 及p-Smad7，室溫孵育1 h 后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加兔二抗室溫孵育90 min，PBS 反復沖洗，發光拍照。

1.4 統計學方法

所有數據應用SPSS 16.0 軟件進計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色檢測PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤組織和正常組織中的表達

骨肉瘤組織中PI3K 及p-Smad7 的表達顯著高于正常組織，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見圖1（封三）。

圖1 免疫組化染色檢測PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤組織和正常組織中的表達（見內文第9 頁）

2.2 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細胞增殖能力的影響

給藥處理48、72 h 后，實驗組的MG-63 細胞增殖能力明顯低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細胞增殖能力的影響

2.3 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細胞克隆形成能力的影響

給藥處理48 h，繼續培養15 d 后，實驗組的MG-63細胞克隆形成能力明顯低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.4 PI3K 抑 制 劑CAL-101 對MG-63 細 胞PI3K 及p-Smad7 表達的影響

給藥處理36 h 后，實驗組的MG-63 細胞PI3K及p-Smad7 表達均明顯低于對照組，且p-Smad7 隨著PI3K 被抑制而顯著降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖4。

3 討論

骨肉瘤是骨科最常見的腫瘤之一，由于惡性骨腫瘤治療效果差，5 年存活率僅為20%[6]。骨肉瘤具有侵襲性強、易復發、治療效果差等特性，導致其治療難度增加。近些年研究發現，PI3K/p-Smad7 信號通路與骨肉瘤的發生、發展、轉移和侵襲密切相關，因此其備受國內外學者的關注[7-8]。

圖3 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細胞克隆形成能力的影響

PI3K 是PI3K/p-Smad7 信號傳導通路中的主要調節蛋白，PI3K 已經被證實為一種促癌基因，是通過原位雜交技術在宮頸癌細胞中發現的，其具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重生物活性，可以活化AKT，從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化和轉移等一系列生物學行為[9-10]。p-Smad7 是TGF-β 信號通路的負調控蛋白，在肝癌中p-Smad7 可以促進肝腫瘤細胞的增殖和轉移[11]。最近的幾項研究表明，p-Smad7/PI3K 信號通路在腫瘤發生、發展過程中起重要作用[12-13]。有研究發現，PI3K 在結直腸癌中的表達增高，同時p-Smad7表達也在增高，其可以激活下游分子Twist 結合導致癌細胞遷移和侵襲能力顯著增加[14-15]。有研究證明，p-Smad7/PI3K 信號通路通過上調N-cadherin 誘導連環蛋白基因和抑制E-cadherin 從細胞質轉移至細胞膜來促進胃癌細胞的侵襲[16]。p-Smad7/PI3K 信號通路通過促進N-cadherin 翻譯間接上調其下游效應基質金屬蛋白酶9，從而促進肝癌轉移[17-19]。研究表明，p-Smad7/PI3K 信號通路在腫瘤遷移和侵襲以及上皮細胞間質轉型發生、發展過程中起重要作用[20-21]。但p-Smad7/PI3K 信號通路對骨肉瘤的影響及對骨肉瘤細胞增殖能力影響如何尚不完全明確。

圖4 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細胞PI3K 及p-Smad7 表達的影響

本研究結果顯示，PI3K 及p-Smad7 表達在骨肉瘤患者癌組織中的表達高于正常組織，提示骨肉瘤的發生發展與PI3K/p-Smad7 信號通路表達有密切的關系。體外細胞實驗表明，PI3K 抑制劑CAL-101 能夠抑制骨肉瘤MG-63 細胞的增殖能力，與腫瘤組織中PI3K 及p-Smad7 表達檢測結果一致，說明PI3K/p-Smad7 信號通路激活促進了骨肉瘤的增殖能力。此外，PI3K 抑制劑CAL-101 給藥處理后MG-63 細胞PI3K 及p-Smad7 表達變化均顯著降低，提示PI3K/p-Smad7 激活可以增強骨肉瘤的增殖、轉移和形成遠端病灶。

綜上所述，PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤中的表達異常增高，從而促進骨肉瘤形成轉移病灶。而PI3K/p-Smad7 信號通路上游如何，其如何來調控PI3K/p-Smad7 信號通路，均有待于進一步研究證實。