多中心風濕免疫病生物樣本庫標準化建設與意義

曾惠瓊，丁慧華，熊力群，唐元家，孫華麟，康曉楠，張 躍，葉志中

生物樣本庫是一種集中保存各種人類生物材料，用于疾病的臨床治療和生命科學研究的生物應用系統。基于收集高質量的結締組織病組織及以血液、尿液為主的體液樣本是發現風濕免疫病遺傳生物標志物及藥物作用新靶點的物質基礎。生物樣本資源的重要性已經得到充分的認識和廣泛的重視[1-2]。2015年,美國宣布啟動精準醫學計劃；2016年,我國科技部將精準醫學納入到“十三五”重大科技專項。精準醫學的發展同樣需要生物樣本庫，作為專項指南明確指出，開展健康隊列、重大疾病、罕見病等研究，必須有生物樣本庫、數據庫等平臺作為課題研究支撐。為了整合深圳市人群病例資源，為臨床與基礎科學研究提供可靠的資源平臺，深圳市福田區風濕病專科醫院自2014年12月開始組建深圳市人群風濕免疫病生物樣本庫，并利用深圳市“三名工程”平臺柔性引進上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院風濕科并與之合作，實現多中心、云共享管理模式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 所有病例均來源于在我院門診及住院風濕病患者，原則上，所有風濕免疫病均具備入庫資格，但基于我院實際情況，我們重點采集系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erethematosus,SLE)、骨性關節炎(Ostoarthritis,OA)、類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)、骨質疏松癥、強直性脊柱炎、干燥綜合癥、系統性血管炎、未分化結締組織病8個病種。所有患者診斷均符合各個病種診斷及治療指南。所有入組患者均填寫詳細問卷，包括一般人口學、疾病、流行病學、家系等資料。

1.1.2 主要設備 4 ℃冰箱(579L，青島海爾集團)，-80 ℃冰箱(DW-86L-286，青島海爾集團)，臺式離心機(600C，北京白洋醫療器械有限公司)，Real-time PCR擴增儀(ABI7300，美國Thermo Fisher公司)，紫外/可見光光度計(NanoDrop 2000，美國Thermo Fisher公司),電熱恒溫水箱(CU-420型，上海一恒科學儀器有限公司)，貝迪打印機(BP-IP300，美國BRADY公司),液氮罐(YDS-65-216，成都金鳳液氮容器有限公司)、-20 ℃、-4 ℃冰箱(BCD-257SL，青島海爾集團)、凝膠電泳分析系統(GDS-8000,英國UVP公司)。另設PCR室、分子生物室、血清室等用于提取核酸，分離淋巴細胞，進行PCR擴增等分子生物學相關研究。

1.2 方法

1.2.1 人員配置與建庫流程 參照上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院風濕科生物樣本庫的建設模式[3]，參考生物樣本庫國際規范和指南標準化建設[4]。結合醫院自身特點，我院生物樣本庫組織架構主要由以下部分組成:執行委員會、學術委員會、倫理委員會、質控小組等。在此基礎上安排科研助理專員、質控專員分別負責樣本的采集和前處理、核酸蛋白提取和質量管理、樣本信息數據管理、樣本出入庫和常務管理等，并按照崗位職責的不同給予相應的培訓內容、方式、要求和頻率，定期參加生物樣本庫標準化建設會議。

1.2.2 倫理規范 收集生物樣本庫樣本必須先征得患者的知情同意并簽署知情同意書。同時經過我院倫理委員會審查，嚴格保護患者隱私和權益。

1.2.3 組織樣本的采集和處理

1.2.3.1 血液樣本的采集與保存 血清、血漿、全血(用于備提RNA，DNA和外周血單個核細胞等)。血液樣本采集選用風濕病患者外周靜脈采血，采集方案選擇應遵循不同項目方案，成人捐獻者采集量一般為10～15 mL，其中10 mL抗凝管，5 mL促凝管。血清樣本使用標準真空負壓采血管，常溫直立靜置30 min，待血液凝固析出血清，分管，標記，入庫。全血采集至抗凝管充分顛倒混勻后，分裝分離血漿和白細胞，標記，入庫。血漿留取后分管，標記，入庫，剩下部分用于分離粒細胞、外周血單個核細胞等，提取后標記，入庫。核對樣本標簽編號后入庫-80 ℃冰箱或液氮罐保存。

1.2.3.2 尿液樣本的采集與保存 尿液采集相對簡單，尿液是蛋白質、代謝物的主要來源之一。我們收集風濕病患者晨尿或隨機尿液、24 h尿液。單次尿液采集量50 mL。根據研究目的和用途，可分為混勻尿、尿液上清和尿沉渣。采集后標記，入庫，將凍存管裝盒后根據系統分配位置凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3.3 唾液樣本的采集與保存 目前采用唾液采集管(Salivette)采集唾液后離心獲得樣本，常溫保存，采集后的唾液根據標準操作規程進行直接分裝或低速離心，產生的上清和沉淀分別單獨保存。唾液樣本建議500 μL/管分裝。若需長期保存可進行凍存(-80 ℃保存)。該樣本與尿液一樣屬于無創性操作，簡單易行，目前國內罕見有生物樣本庫存儲此類樣本，開發用于唾液收集和基于SOPS標準對于建立一個新的唾液生物樣本庫至關重要[5-7]。

1.2.3.4 關節液樣本的采集與保存 多種風濕病發病以關節滑膜增生為主要病理基礎，患者常伴有關節腫脹，所以，采集關節液對關節局部炎癥等病變分析有重要作用。通過門診或住院醫師無菌操作取得關節液，抽出液體后，要記錄液體數量，樣本庫留取樣本分裝在2支無菌采集管內，其中一個管不加抗凝劑，另一個管加適量肝素抗凝用做細胞學檢查；將樣本貼好標識碼標簽，-80 ℃保存。

1.2.3.5 糞便樣本的采集與保存 有文獻證實，多種風濕病發病與腸道菌群失調相關[8]。因此，風濕病專病樣本庫樣本也納入了糞便采集。測定腸道菌群一般常用16SrRNA基因序列分析技術檢測，因此，選擇滅菌封口特定容器，收集2～5 g或2～5 cm3固態狀(或2～5 mL液態狀)新鮮糞便，無須離心，樣本分管貼好標識碼標簽，-80 ℃保存。如果需要測定代謝物則將上法采集新鮮糞便用研缽研碎混勻，取0.5 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL75%甲醇溶液，離心取上清液，加入10%氨水備用，采用氣相色譜-質譜聯用法分析。

1.2.3.6 DNA /RNA的提取 按試劑盒要求提取DNA；RNA的提取選用傳統的Trizol法，標記，入庫，分別儲于-80 ℃冰箱和液氮罐。在樣本收集到入庫整個過程中，對從樣本中提取的DNA/RNA樣本，需定期抽查濃度、純度，鑒定合格后可繼續保存。所有樣本應避免反復凍融。

1.3 臨床資料庫建立與信息采集系統管理 樣本庫管理軟件采用IBIO-GENE V2.2.49.0版本，通過與醫院信息系統(hospital information system,HIS)/實驗室信息系統(laboratory information system,LIS)/廣東省醫療機構病案統計管理系統(Guangdong Province medical institutions health record and statistics,MIS)對接,利用存儲設備，完善管理(包括樣本采集、患者信息、設備、實驗信息、用戶信息、統計輔助等多方面管理)，方便數據科研/臨床提取及校正，提高了樣本庫工作效率。實現對樣本狀態和使用情況有序化、權限化、多中心的院級共享安全管理。

1.3.1 臨床資料庫建立與管理 包括：①臨床信息采集；②信息整理入庫；③原始紙質臨床資料存放與管理；④出入庫管理；⑤庫存核實；⑥樣本接收、運輸、銷毀、安全管理；⑦云端共享管理。

1.3.2 臨床信息采集管理 將預錄入樣本的臨床資料信息包括住院號/門診號、性別、姓名(為保護患者隱私使用英文縮寫)、診斷、家系、個人史、既往史、病史、實驗室報告、藥物治療情況、預后與轉歸等所有信息輸入信息系統內。

1.4 質控管理 質控管理包括質控人員管理和樣本質控。生物樣本庫的質量控制包括流程控制和樣本質量檢測。

2 結果

2.1 樣本收集情況 我院自2014年12月起籌建風濕免疫病生物樣本庫，于2014年12月開始收集樣本，截至2019年7月31日，共計收集風濕免疫病病例736人次及52人次健康對照者，主要涉及8個病種，其中SLE 193人次，RA 149人次，OA 102人次，脊柱關節病40人次，骨質疏松癥61人次，干燥綜合征52人次，血管炎7人次，結締組織病120人次。目前收集的788人次樣本中，男性233人次，占29.6%；女性555人次，占70.4%，收集樣本的年齡最小11歲，最大80歲。

2.2 樣本管理

2.2.1 單個樣本錄入路徑與質控 參照SOPS標準，生物樣本庫中樣本的出入庫全程實施標準化管理，必須按二維條形碼識別定位歸放并由專人負責管理。使用生物樣本必須按照流程進行申請、審批、取樣。在樣本出庫后管理員需追蹤出庫樣本的基本試驗數據，做到對樣本的采集與庫中質量的二次監管。為確保實驗室全體員工熟悉生物安全法律、法規，建立生物安全意識，保證相關工作人員掌握開展工作必需的生物安全知識和技術，避免實驗室感染，防止實驗室事故，生物樣本庫工作人員需定期接受安全培訓和考核。樣本庫收集部分血液、尿液樣本編碼及二維條形碼見圖1。

圖1 生物樣本庫血液、尿液樣本編碼及二維條形碼

因RNA、DNA易降解，存在不穩定性，為避免樣本在今后使用時反復凍融降解RAN、DNA和影響蛋白質結構，應當盡可能將樣本以最小單位分裝。分裝也同時是為了提取方便和減少樣本浪費。樣本質量控制根據不同樣本情況采取不同手段。例如：液態樣本(血清、血漿、尿液、關節液等)需對其中特定物質定期檢測；固體組織如：滑膜成分，由病理專家等共同完成，通過顯微鏡檢查和對核酸/蛋白質等大分子檢測進行質控。質控包括數據、取材處理各個環節時間記錄、形態復檢、生物大分子穩定性分析等等。生物樣本庫質控每半年進行1次，隨機采樣3份，使用紫外分光光度計測RNA完整性。數據信息安全是生物樣本庫安全的重要組成部分，安全保存采集的數據，限定使用者權限，防止數據的非法獲取。每個接觸生物樣本庫信息系統的工作人員都應該簽署一份保密協議，信息系統自動備份。

2.2.2 樣本共同管理 采用IBIO-GENE科研數據庫信息管理系統V2.2.49.0版本，實現樣本儲存、共享信息的可視化管理，同時具有檢索、歸類等多種功能。2017年，我院獲得深圳市政府“醫療衛生三名工程”立項，成功引進上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院沈南教授風濕病精準醫學研究團隊。通過數據庫聯網，實現跨地域、多中心與上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院風濕科生物樣本庫實現云共享。通過積極推動生物樣本庫利用，避免了“臟庫”、“死庫”發生。同時正在進一步吸引、擴大同行業合作單位和研究范圍，期望實現多中心收集標本、建立華南地區生物樣本庫聯盟，擴大和維持研究競爭力、可持續發展勢態。

3 討論

SLE，OA、RA等[9-10]風濕免疫病屬于高度異質性風濕病，發病機制復雜，嚴重影響國民健康與國家經濟。據統計，美國因此每年造成經濟損失多達3 200億美元以上。流行病學調查顯示，我國僅RA的發病率達0.6%～1.0%，自身免疫性風濕病患者人數已超過1億，到2020年將達2億；而臨床上SLE、RA等風濕免疫性疾病目前主要采用抗炎和免疫抑制方法進行治療，以糖皮質類激素聯合細胞毒藥物為主，不良反應大，感染已成為風濕免疫性疾病致死的首要因素。因此，尋找風濕免疫病生物標志物、新的治療靶向藥、中西醫結合等方向治療成為全球共同關注問題。隨著治療手段不斷更新，不同類型干細胞、富血小板血漿、影響自噬相關通路藥物在OA、SLE等疾病治療中應用[11]。專病生物樣本資源是一類重要的生物樣本資源[12],臨床科研要驗證醫療精準性，建立生物樣本庫、干細胞庫的作用意義重大。

生物樣本庫模式目前有2類，一類是采用英國模式，即由政府出資組建生物樣本庫；另一類是采用歐盟模式，即建立“分散實體庫+統一信息庫”的生物樣本庫聯盟網絡[13]。國外相關專病生物樣本庫發展已經積累了一定的經驗，值得我們參考。丹麥自2007年啟動全國多中心風濕免疫病生物樣本庫建設[14]，目的是促進對炎癥性風濕病患者進行個性化治療以及新生物標志物的鑒定。2011年，歐洲抗風濕病聯合硬皮病試驗研究小組[15]建立了一個在線數據庫，目的是通過隊列研究開發系統性硬化癥的新型生物標志物和尋求新的治療方法,管理經驗值得其他地區風濕免疫病生物樣本庫借鑒。

國內外現有的生物樣本庫都在積極開展資源共享、互相合作模式，通過共同搭建平臺[16]，解決共享存在的普遍問題：樣本質量評估、樣本種類不全、供需雙方信息未及時更新等[17]。近年來中國在生物樣本庫共享方面有一定的進展，以北京生物銀行、國家基因庫聯盟為代表的生物樣本庫共享網絡相繼成立，國家規劃層面也提出了生物樣本庫共享要求和設想，一些專病樣本庫建設標準陸續出臺。我院建立的生物樣本庫主要采用分散實體庫與統一信息庫結合模式，通過重點專科專項經費維持，保證樣本庫正常運營。由于建立規范專病生物樣本庫與專科遺傳資源、表觀信息、分子流行病學調查等相應臨床信息關系密切，在建立風濕免疫病生物樣本庫上，按照SOPS組織架構、專員管理、嚴格倫理流程和質控管理，推動專病生物樣本庫合理化、規范化、標準化、共享化發展。避免采集時間倉促、采集量不足、信息可信度差等缺點，確保樣本的質量和數量。

2017年7月8日,國務院印發《新一代人工智能發展規劃》,利用人工智能建立生物樣本庫“云”資源共享平臺的設想已經提出[18]。國外在實現機構間合作研究方面有很多成功嘗試例子，包括合作的前列腺癌組織資源，賓夕法尼亞州癌癥聯盟生物信息學聯合會，合作乳腺癌組織資源，合作人類組織網絡，癌癥家族注冊管理機構等，但尚未達成全球共享平臺[19]。我們通過結構化采集方式、表單設計填寫、醫院HIS/LIS/MIS系統對接、二維碼標識掃描規范臨床數據采集流程，通過將工作流程轉化存儲生物樣本到電子信息，設計并實施了備份解決方案，確保日常專科生物樣本庫的覆蓋范圍，并將備份資料分布到遠程服務器或云共享APP上定期進行網絡、操作系統、參數等優化，實現可視化管理，保證樣本臨床信息的完整準確、數據的完整性、真實性、統一性，無須增加人員成本和軟件成本。我們與上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院風濕科姊妹庫共享資源、信息、技術及人才平臺等，共同承擔科研項目，實現地區專科產業突破。不但有效保護、合理開發和充分利用了專病生物資源，而且提高了專科研究水平，還促進了專病診治進展及實現惠及民生的醫療目標，具有較大社會經濟效益。多方合作生物樣本庫之間應確定統一完整的本體，數據集平臺必須有上下級隸屬合作關系，并成立第三方管理機構監管互通模式；應用信息管理軟件，使用微軟服務器及Excel編輯信息，通過嚴格審核、定制和開放共享網絡共同管理，推動存量資源改造[20]。引入云計算和遠端服務，檢測溫度、安全系統、樣本追蹤；加強頂層設計，落實監管、法律、資金和服務平臺等保障;建立行之有效的生物樣本庫共享利益分配機制，認真貫徹倫理和生物安全保護。

目前我國生物樣本庫仍面臨一些問題和挑戰。相關的生物樣本資源不斷積累，卻沒有得到妥善的收集與整理、或者一些生物樣本庫得不到合理利用而成為“臟庫”、“廢庫”、“死庫”。如何實現現有生物樣本資源共享，己成為當下各國生物樣本庫建設和發展所共同面對的難題。生物樣本庫的出現所帶來的一些倫理、法律和社會問題，包括從弱勢群體(臨床上通常是患者)收集捐款的公平性，對捐助方而言的知情同意，向參與者披露數據的管理、知識產權所有權以及參與方的隱私和安全[21]。由于這些新的問題，研究人員和決策者需要建立新的研究治理體系。

期待以我院風濕免疫病生物樣本庫為基礎，聯合深圳市-廣東省-華南地區更多合作單位，不斷充實風濕免疫病的病種及系統生物樣本，通過大樣本的關聯分析，實現大數據在生物樣本庫的充分價值體現，將有利于動態縱向觀察風濕免疫病發生、發展和轉歸的規律。下一步將開展干細胞庫建立和管理，為風濕免疫病臨床和基礎研究提供物質基礎。