MiR-29a及其靶向基因在宮頸癌中的表達和臨床意義

徐啟英，郭桂蘭

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其發病率呈逐年升高的趨勢。全世界每年約有新發病例50萬[1]。MicroRNA(miRNA)是一類內源性的非編碼RNA，它們經過一系列的加工后可以形成大小約20～22 bp的單鏈小分子RNA，通過識別miRNA的3′UTR可以靶向誘導相應的miRNA降解或抑制其翻譯[2]，從而影響蛋白質的表達，Tong和Nemunaitis[3]認為機體內具有癌基因活性的miRNA和具有抑癌基因活性的miRNA是保持動態平衡狀態的，一旦這種平衡被打破，細胞就會向惡性轉化。因此，miRNA成為深入研究惡性腫瘤發生發展，診斷治療的新靶點。MicroRNA-29a(miR-29a)目前是miRNAs系列中研究熱點的成員之一，研究已證實，miRNA-29a在很多不同類型的腫瘤中如前列腺癌、腎細胞癌、胃癌和胰腺癌不表達或者低表達，但miRNA-29a在宮頸癌中的作用尚不清楚。本研究旨在檢測miRNA-29a在宮頸鱗癌組織和細胞中的表達水平，并探討miRNA-29a的靶向基因DNA甲基轉移酶3A(DNA-methyltransferase 3 A，DNMT3A)基因、DNMT3B基因在宮頸癌組織和宮頸癌細胞中的表達水平，為進一步研究宮頸癌的發病機制和尋找腫瘤標志物及開發治療方法提供初步理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集青海大學附屬醫院婦科2015年6月—2017年6月收治的20例宮頸鱗癌患者的癌組織及癌旁組織，所有標本的臨床分期均根據國際婦產科聯盟(1995)，其中Ⅰb期12例，Ⅱa期8例，均為鱗癌。患者術前均簽署知情同意書，研究方案經本院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗細胞、主要試劑和儀器 人宮頸癌細胞系Hela和人正常宮頸細胞株ECT-1(購自中國科學院上海細胞庫，由青海大學高原醫學研究中心保存);miR-29a模擬物(miR-29a mimic)、無關序列陰性對照(microRNA negative control，miR-NC)片段及靶向基因DNMT3A、DNMT3B的引物片段(購自上海吉瑪生物公司)，mRNA提取試劑(日本TaKaRa公司)，實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR,qRT-PCR)試劑(德國DBI公司)，焦碳酸二乙酯(美國Sigma公司)，RNasin(美國Promega公司)，逆轉錄試劑盒(德國DBI公司)，標準胎牛血清(英國Gibico公司)，RPMI1640培養液(美國HyClone公司)，分光光度計(型號：UV-1206，日本島津公司)，PCR擴增儀(型號：ABI9700，美國ABI公司)，qRT-PCR儀(型號：Stratagene Mx3000P，美國Agilent公司)，DNMT3A、DNMT3B酶聯免疫吸附測定試劑盒(美國Epigentek公司)，酶標儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測組織和細胞中miR-29a的表達 Trizol法提取組織或細胞總RNA，檢測濃度與質量，光密度(optical density，OD)值在1.8～2.2間方可使用。按照BestarTMqRT-PCR RT Kit以及DBI Bestar?SybrGreen qRT-PCR masterMix進行反轉錄和PCR。用Agilent Stratagene qRT-PCR儀Mx3000P進行qRT-PCR實驗。實驗按照2-△△Ct方法處理數據。其中，△Ct=(目的基因Ct-內參Ct)的平均值±標準偏差；△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)的平均值±標準偏差(若無參照樣品則選擇Ct最大的樣品為參照進行計算)。MiR-29a引物由日本TaKaRa公司設計合成，序列為:5′-TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-3′。以U6作為內參，其特異性引物序列為:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。重復3次。

1.2.2 ELISA法檢測細胞中DNMT3A、DNMT3B的表達 按照DNMT3A、DNMT3B酶聯免疫吸附測定試劑盒操作方法進行操作，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的OD值，以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線圖，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.2.3 Western Blot法檢測組織中DNMT3A、DNMT3B表達 將組織用RIPA裂解液進行裂解，裂解的蛋白需要BCA進行定量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒流35 mA、1 h)。經凝膠電泳分離后，將蛋白半干轉至聚偏二氟乙烯膜上(20 V，1 h),用含5%脫脂奶粉的TBS進行封閉。一抗(兔抗人DNMT3A、兔抗人DNMT3B)室溫孵育2 h，TBST洗膜3×5 min;二抗(羊抗兔HRP)室溫孵育1 h，TBST洗膜3×5 min,ECL顯影。使用Image J軟件測定條帶灰度值。

1.2.4 Western Blot法檢測細胞中DNMT3A、DNMT3B表達 宮頸癌細胞系Hela和人正常宮頸細胞株ECT-1細胞生長于RPMI1640培養液，置于37 ℃、100%飽和濕度、5%濃度的CO2培養箱中培養。細胞呈單層貼壁生長，細胞融合度達到80%～90%時進行常規傳代。將Hela細胞以3×104/孔接種于24孔板中，實驗分為3組：Hela細胞空白(control)組、miR-29a模擬物(miR-29a mimic)組、無關序列陰性對照(microRNA negative control，miR-NC)組。根據Lipo3000(美國ThermoFisher公司)的說明書進行細胞轉染操作。轉染48 h后，收集細胞并用60 μL 1×SDS buffer裂解。以下的操作同1.2.3。

2 結果

2.1 MiR-29a在宮頸鱗癌組織和癌旁組織中的表達 2%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產物為單一條帶，表明qRT-PCR可特異擴增miR-29a片段。MiR-29a在宮頸鱗癌組織中的相對表達量(2-△△Ct)為0.39±0.21，低于癌旁組織1.10±0.49，差異比較具有統計學意義(P<0.01，圖1)。

2.2 宮頸鱗癌組織中miR-29a的表達和臨床分期的關系 不同臨床分期的宮頸鱗癌組織中miR-29a的表達有差異，Ⅱa期宮頸鱗癌組織中miR-29a的相對表達量為0.23±0.07，低于Ⅰb期0.50±0.20，差異比較具有統計學意義(P<0.01，圖2)。

2.3 MiR-29a在人宮頸癌細胞系Hela和正常宮頸細胞系ECT-1中的表達 經qRT-PCR檢測miR-29a在人宮頸癌細胞系Hela中的相對表達量為0.37±0.19，低于在正常宮頸細胞系ECT-1中的相對表達量1.16±0.82，差異比較具有統計學意義(P<0.01，圖3)。

圖1 宮頸鱗癌組織和癌旁組織中miR-29a的相對表達量圖2 不同臨床分期宮頸鱗癌組織中miR-29a的相對表達量圖3 宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中miR-29a的相對表達量

2.4 DNMT3A、DNMT3B在組織中的表達和與臨床分期的關系 經Western Blot檢測宮頸鱗癌組織中DNMT3A的相對表達量為1，癌旁組織中的相對表達量為0.28±0.09;Ⅱa期宮頸癌組織中DNMT3A的相對表達量為1.17±0.17，高于Ⅰb期的0.88±0.12;Ⅱa期宮頸鱗癌癌旁組織中DNMT3A的相對表達量為0.38±0.11，高于Ⅰb期的0.21±0.06，差異比較具有統計學意義(P<0.01)。宮頸鱗癌組織DNMT3B的相對表達量為1，癌旁組織中的相對表達量為0.14±0.04，Ⅱa期宮頸鱗癌組織中DNMT3B的相對表達量為1.29±0.21，高于Ⅰb期的0.80±0.14;Ⅱa期宮頸鱗癌癌旁組織中DNMT3B的相對表達量為0.18±0.03，高于Ⅰb期的0.11±0.02，差異比較具有統計學意義(P<0.01)。圖4。

2.5 DNMT3A、DNMT3B在人宮頸癌細胞系Hela中mRNA的表達 Hela細胞株過表達miR-29a后，qRT-PCR檢測Hela細胞不同轉染組中的DNMT3A，DNMT3B的mRNA表達水平,結果表明miR-29a模擬物(miR-29a mimic)組DNMT3A mRNA(0.41±0.11)，DNMT3B mRNA(0.26±0.08)的相對表達量遠低于Hela細胞空白(control)組和無關序列陰性對照(miR-NC)組，差異比較具有統計學意義(P<0.05，圖5)。

注：與癌旁組織比較，**P<0.01；與Ⅱa期比較，*P<0.01圖4 宮頸鱗癌和癌旁組織中DNMT3A、DNMT3B的相對表達量

注：與miR-NC組比較，*P<0.01；與control組比較，**P<0.01圖5 人宮頸癌細胞系Hela中DNMT3A、DNMT3B的mRNA表達量

2.6 DNMT3A、DNMT3B在人宮頸癌細胞系Hela中蛋白的表達 用ELISA實驗測定不同轉染組中DNMT3A，DNMT3B蛋白表達水平，結果表明Hela細胞過表達miR29a后，DNMT3A，DNMT3B的蛋白表達均下降，差異比較有統計學意義(P<0.01，表1)。同時經Western Blot再次檢測Hela細胞在不同轉染組中DNMT3A，DNMT3B的蛋白表達水平，結果顯示與Hela細胞空白(control)組和無關序列陰性對照(miR-NC)組比較，miR-29a模擬物(miR-29a mimic)組中DNMT3A，DNMT3B的蛋白表達均不同程度的下調，差異比較具有統計學意義(P<0.01，圖6)。Western Blot檢測結果與ELISA的結果相吻合。

表1 不同轉染組細胞中DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達水平

注：與Hela細胞空白(control)組和無關序列陰性對照(miR-NC)組比較，*P<0.01

注：與miR-NC組比較，*P<0.01；與control組比較，**P<0.01圖6 人宮頸癌細胞系Hela中DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達水平

3 討論

人乳頭瘤病毒持續感染是宮頸癌發病的初始步驟，但是其發展還需要多因素的共同作用，miRNA被認為是此過程中的重要因素。自從miRNA在B細胞慢性淋巴細胞白血病的表達發生改變被證實后[4]，對miRNA在不同組織和細胞中差異性表達的研究顯著增多，有大量的研究對宮頸癌中miRNA的表達譜進行了分析[5-7]，表明了一些miRNA在宮頸癌中的差異性表達，而這些差異性表達的miRNA可能成為宮頸癌早期診斷和治療的重要靶點。其中miR-29a表達下調顯著[5]，miR-29可調控人體細胞中參與細胞代謝、分化、凋亡、遷移、免疫等過程的相關基因表達，多種腫瘤和疾病中存在miR-29的異常表達。在橫紋肌肉瘤細胞和原發性腫瘤中miR-29a可誘導細胞分化并抑制腫瘤生長，此過程受NF-κB-YY1通路調控[8]。體外細胞培養模型，乙肝病毒X蛋白在促進肝癌細胞HepG2遷移中miR-29a-PTEN-Akt調控起關鍵作用[9]。但是目前國內有關miR-29a與宮頸癌的發生發展的相關研究報道不多。

黃智述和任黔川[10]的研究顯示，不同的宮頸病變組織中表達水平有差異，隨著宮頸病變由正常宮頸和低度鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)逐步向高度鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)和宮頸癌演變的過程中，miR-29a的表達水平逐步減低，miR-29a在正常宮頸和LSIL組織中表達水平相對較高，而在宮頸鱗癌及HSIL組織中呈低表達，且miR-29a在宮頸鱗癌組織中的表達低于HSIL。吳玉萍[11]的研究也表明miR-29a在宮頸癌組織中的表達量明顯低于正常宮頸組織，且miR-29a在Ⅱa期宮頸癌組織中的表達量明顯低于Ⅰa期和Ⅰb期。本研究顯示，miR-29a在宮頸癌組織中的表達量低于癌旁組織，且Ⅱa期宮頸癌組織中miR-29a的相對表達量低于Ⅰb期，與國內學者的研究結果基本一致。同時本研究對正常宮頸細胞系和宮頸癌細胞系檢測發現，miR-29a在宮頸癌細胞系中的mRNA和蛋白的表達均低于正常宮頸細胞系，推測miR-29a的表達下調可能與宮頸癌的發生、發展有關。

DNMT3A和DNMT3B分別位于2p23和20q11.2，其編碼的蛋白質為DNA甲基轉移酶DNMT3A和DNMT3B，可使未甲基化的DNA雙鏈發生甲基化。DNA甲基化異常與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，當DNA甲基化酶水平升高，其可導致抑癌基因失活或癌基因的激活，進一步影響惡性腫瘤易感性及機體對化療的敏感性[12]。DNMT3A和DNMT3B在多種實體腫瘤和造血系統腫瘤中表達升高，但有關宮頸癌的相關研究較少。在本研究中，DNMT3A、DNMT3B在宮頸鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且在Ⅱa期宮頸癌組織中的相對表達量高于Ⅰb期，考慮DNMT3A、DNMT3B的高表達與腫瘤的侵襲、轉移及預后相關。在本研究中，轉染人宮頸癌Hela細胞株過表達miR-29a后DNMT3A、DNMT3B的mRNA和蛋白的相對表達量均明顯下降，也證實了DNMT3A、DNMT3B是miR-29a的靶基因，但其具體作用機制仍有待進一步研究。

腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移等惡性生物學行為是腫瘤進展的重要原因。本研究顯示miR-29a在宮頸癌組織中呈低表達，DNMT3A及DNMT3B在宮頸癌組織中呈高表達，且轉染人宮頸癌Hela細胞株過表達miR-29a后DNMT3A及DNMT3B的mRNA和蛋白的相對表達量明顯下降，推測miR-29a可能為抑癌基因，它可能通過降低DNMT3A及DNMT3B的表達來發揮其抑癌作用，推測miR-29a可能調控宮頸癌的發生與發展，但有關miR-29a調控腫瘤細胞惡性生物學行為的具體分子生物學機制尚不明確。目前國內外對于miR-29a、DNMT3A及DNMT3B在宮頸癌中的具體作用及其機制研究尚不完善，本研究雖然提示miR-29a在宮頸癌組織中的表達量低于癌旁組織，DNMT3A及DNMT3B在宮頸癌組織中的表達量高于癌旁組織，且隨著腫瘤分期的增加，miR-29a的相對表達量有所降低，DNMT3A及DNMT3B的相對表達量有所增加，但是由于樣本量較少的客觀原因，仍需要更大樣本量的研究以驗證。