HIV/HBV合并感染者HBV核心區與多聚合酶區特異性細胞毒性T細胞表位變異分析

鄧西子，聶 源，蘭 蕓，李 鋒，高 鳴，蔡衛平，李凌華，胡鳳玉

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的特異性細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)通過識別HBV抗原表位，在清除細胞內感染病毒發揮關鍵作用。HBV的核心(core,C)區和多聚合酶(polymerase,P)區基因變異導致編碼的氨基酸突變，CTL抗原表位的序列或構象發生改變進而引起表位的免疫原性改變，導致宿主抗HBV的免疫應答發生改變。若反應強度不足，病毒難以清除，感染慢性化從而進展為肝硬化、肝癌[1-2]。研究報道，合并人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染造成的免疫缺陷明顯加速HBV所致的肝病進程，終末性肝病(包括肝硬化、肝癌、肝衰竭)已成為HIV感染者死亡的首要原因，具體機制不明[3-4]。目前，HIV/HBV合并感染是否影響HBV的C蛋白和P蛋白的特異性CTL表位變異進而與肝病進程加快關聯尚缺乏相關報道。本研究擬以直接測序法，對HIV/HBV合并感染者C區和P區的CTL表位變異進行檢測分析，并以HBV單一感染者為對照，研究HIV/HBV合并感染者C區和P區的CTL表位變異特征，為深入探討HIV/HBV合并感染者疾病進展和轉歸的致病機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2009年1月—2011年12月廣州醫科大學附屬廣州市第八人民醫院收治的慢性HBV感染者，依據治療前HIV抗體檢測結果分為HIV/HBV合并感染組和HBV單一感染組。所有患者均經過乙肝血清標志物檢測且表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性>6月確診HBV感染，所有HIV/HBV合并感染者均經過酶聯免疫吸附實驗和蛋白質印跡法確診抗-HIV陽性。獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)和慢性HBV感染的診斷見參考文獻[5-6]。成功擴增C區和P區的慢性HBV感染者共151例，其中HIV/HBV合并感染者83例，HBV單一感染68例。2組患者性別組成、年齡、基因型、HBeAg狀態、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、HBV載量差異比較均無統計學意義(P值均>0.05)。排除標準：合并有其他肝炎病毒的感染和AIDS相關性的明顯的機會性感染；已進行抗病毒治療；明顯的肝硬化、肝衰竭和肝癌等終末性肝病；年齡<18歲、孕婦、哺乳期者；HBV載量<500 U/mL。本研究所采用的樣本來自于患者臨床常規檢測剩余的血清樣本，研究經醫院倫理委員會審查和批準并獲得受試者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV基因擴增 采用QIAamp DNA mini Kit(250)試劑盒(美國羅氏公司)提取血清中的HBV DNA。HBV DNA擴增：PCR第1輪反應：正向引物5′-GTTCATGTCCWACTGTTCAAGCCTCCAAG-3′；反向引物5′-GTTGCATGGTGCTGGTGMRCAGACCAA-3′，擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 200 s(循環30次)；延伸72 ℃ 7 min。PCR第2輪反應：正向引物5′-GGTCTTRCATAAGAGGACTCTTGGACT-3′；反向引物5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3′，擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 200 s(循環35次)；延伸72 ℃ 7 min。

1.2.2 DNA序列分析 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認后送英濰捷基(Invitrogen)公司進行測序,測序方法為Sanger雙氧鏈末端終止法測序。測序引物：片段1：P1(正向)5′-CATCCTGCTGCTATGCCTCA-3′，P2(反向)5′-AGAGGTTCCTTGAGCAGG-3′，P3(正向)5′-CCTATTGATTGGAAAGTATGTC-3′，P4(正向)5′-GACGTCCTTTGTTTACGTCC-3′；片段2：P5(正向)5′-GGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3′，P6(反向)5′-AGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3′，P7(正向)5′-GTGGGTCACCATATTCTTGG-3′，P8(正向)5′-TTGGTGTCTTTTGGAGTGTG-3′。采用ContigExpress軟件進行序列整理、拼接，采用Vector NTI軟件對基因序列與參考序列進行比對，計數含有表位變異的序列數。參考序列號：B1 D00329；B2 AF121249；B3 M54923；B4 AY033072；B5 AB219429；C1 AY057947；C2 AY217378；C3 X75665；C4 AB048705；C5 AB241111。HBV C區和P區抗原表位見參考文獻[7-8]。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，2組患者表位變異率比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異比較具有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者CTL表位變異差異分析 HBV C區和P區含有10個抗原表位位點，HIV/HBV合并感染組較HBV單一感染組CTL表位變異發生率偏高，其中C18-27、C88-96、C139-148表位變異發生率差異比較具有統計學意義(χ2=7.509，P=0.006;χ2=3.902，P=0.048;χ2=4.238，P=0.040)。基因型對2組患者表位變異發生率無明顯影響(數據未給出)。各CTL表位變異率和分析結果見表1。

2.2 2組患者CTL表位變異氨基酸分析 表位的氨基酸變異中，多數只有一個氨基酸替換為其余氨基酸，只有C139-148和P575-583表位出現2個位點氨基酸的替換。C18-27表位主要變異的氨基酸，HBV單一感染組有I27V(4.4%)，而在HIV/HBV合并感染組除I27V(6.0%)變異外，還有新的S26N(4.8%)、S26T(4.8%)變異類型。C88-96、C139-148表位主要變異氨基酸(L95I、T147A)兩組患者相同，但顯示HIV/HBV合并感染組更高的比例。具體CTL表位氨基酸變異見表2。

表1 2組患者CTL表位變異發生率[n(%)]

注：與HBV單一感染組比較，*P<0.05

表2 2組患者CTL表位變異氨基酸

注：變異的氨基酸以下劃線表示。

3 討論

由于HIV和HBV有相似的傳播途徑(性接觸、血液傳播、垂直傳播)，HIV感染者常合并HBV感染，我國HIV/AIDS人群中合并HBV感染率為4.2%～19.4%[9]。高效抗逆轉錄病毒療法雖可同時抑制患者HIV和HBV復制，延長HIV感染者的預期壽命，但都不能徹底清除HIV病毒庫和HBV cccDNA，HBV所致的終末性肝病已成為HIV/AIDS患者死亡的首要原因，但具體機制不明[3-4]。HBV特異性CTL應答是決定宿主能否有效清除細胞內HBV的關鍵因素，CTL細胞通過識別HBV抗原特異性表位清除病毒，如果表位中氨基酸發生變異，降低與CTL細胞受體的親和力，可使HBV逃避免疫監視，加快肝病進展[10]。HBV基因組的C區編碼的C蛋白和P區編碼P蛋白包含多個能被有效識別的抗原表位，我們的研究結果顯示，HIV/HBV合并感染組較HBV單一感染組C區和P區的CTL表位變異發生率整體偏高，其中C18-27、C88-96、C139-148 CTL表位變異發生率差異比較具有統計學意義。研究報道，在未經治療的HIV感染者胃腸道CD4+T淋巴細胞的消耗導致微生物易位增加，引起循環中脂多糖水平升高，脂多糖可結合Toll樣受體4并激活核因子-κB等其他通路，導致促炎癥細胞因子產生和免疫過度的慢性活化[11-12]。HIV/HBV合并感染及其造成的免疫改變在HBV分子進化中扮演重要的調控作用[13]。本研究發現HIV/HBV合并感染組CTL表位變異率較高可能是病毒逃避宿主免疫壓力作用下選擇的結果。

HBV的全基因組編碼多種病毒蛋白，其中C蛋白的抗原性最強，保守性最好，C蛋白能引起較其他蛋白更強的CTL應答。研究報道，HIV/HBV合并感染者有更高的1762T/1764A突變[14]，同樣也有報道在HIV/HBV合并感染者常見-1G缺失突變[15]，然而來自泰國的研究報道，2組C區基因變異無差異[16]，但是這些研究都是基于直接序列分析結果，涉及抗原表位變異的研究甚少。本研究發現HIV/HBV合并感染組C18-27、C88-96、C139-148 CTL表位變異率較HBV單一感染組顯著增加。CTL表位變異與病程的進展有明顯的相關性，尤其是C18-27表位[17]，此結果可為深入研究合并感染致病機制提供實驗依據。變異氨基酸結果顯示，HIV/HBV合并感染組的C18-27表位主要變異氨基酸的類型增多，出現獨特性S26N(4.8%)、S26T(4.8%)變異，而C88-96、C139-148表位2組患者主要變異氨基酸類型相同。P區表位變異比較中，2組之間無明顯差異，其中包括有致拉米夫定耐藥的YMDD位點的P551-559(YMDDVVLGA)表位。

綜上，本研究通過分析HIV/HBV合并感染組與HBV單一感染組HBV的C區和P區的CTL表位變異差異，發現HIV/HBV合并感染可增加HBV CTL表位變異，尤其是HBV C18-27、C88-96、C139-148表位變異，提示HIV/HBV合并感染者肝病進程加快可能與HBV C區的CTL表位變異增加相關，具體影響機制有待深入研究。