食管癌患者來源異種移植模型的構(gòu)建及組織學(xué)觀察

王佩文，柏 文，鞠前前，史 輝，蔣茂榮

食管癌是較為常見的惡性腫瘤之一，2017年，國家癌癥中心發(fā)布了中國最新癌癥數(shù)據(jù)，其中食管癌位居第4位[1]。在全世界范圍內(nèi)，食管癌的年平均發(fā)病率為30/100 000，5年生存率為15%～25%。由于多方面的因素(包括飲食、環(huán)境和生活習(xí)慣等)，中國是世界上食管癌發(fā)病率最高的國家。盡管醫(yī)療水平一直在進步，食管癌依然是死亡率較高的一種疾病，傳統(tǒng)治療方案(如手術(shù)切除、化療、放療)難以達到滿意的治療效果[2-3]。

人源腫瘤異種移植(patient-derived xenograft,PDX)模型是指把臨床患者新鮮的腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，依靠小鼠的內(nèi)環(huán)境進行生長而形成的移植瘤模型。PDX模型基本復(fù)制了患者腫瘤的異質(zhì)性，能較好保留原發(fā)腫瘤的組織病理結(jié)構(gòu)和遺傳特性，因此被認為是最接近臨床患者腫瘤的體內(nèi)模型[4]。但是經(jīng)過傳至第2代的PDX模型，組織學(xué)特性與細胞形態(tài)是否保留原發(fā)腫瘤組織的病理特性，是否能較好體現(xiàn)原發(fā)腫瘤的特征，仍需要進一步研究。本研究旨在研究不同代的移植瘤與初代患者腫瘤病理學(xué)特性有無明顯差別，以及傳代之后的移植瘤的成瘤速度和表觀差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食管癌組織標本 患者來源的食管癌組織均來自南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，患者平均年齡70歲。患者術(shù)前均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗動物 取用SPF級BALB/c裸鼠9只，體重20～22 g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心[實驗動物許可證編號：SCXK(滬)2017-0005]，動物實驗和飼養(yǎng)在南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF屏障環(huán)境內(nèi)[實驗動物許可證編號：SYXK(蘇)2017-0046]，實驗和飼養(yǎng)條件嚴格遵守標準化操作規(guī)程的規(guī)范要求(南通大學(xué)實驗動物使用與管理委員會批準號：20170303-004)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.3 主要試劑 多聚甲醛、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 食管癌組織的收集 臨床手術(shù)剛切除的食管癌腫瘤組織，立刻置于提前預(yù)冷的含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基(4 ℃)中，冰上保存運輸(0 ℃)。

1.2.2 病理鑒定 食管癌腫瘤組織病理鑒定均由南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科進行。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會第8版TNM分期系統(tǒng)標準進行腫瘤分期[5]。

1.2.3 食管癌PDX模型的建立 收集的食管癌腫瘤組織于實驗室無菌超凈臺中去除腫瘤周圍壞死組織和部分毛細血管，將部分腫瘤組織在培養(yǎng)基中切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，置于4%的多聚甲醛中固定。裸鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉溶液，劑量為50 mg/kg，取組織塊于套管針內(nèi)，于裸鼠右腋下接種，裸鼠蘇醒前放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，此為食管癌PDX模型初代(P0)。每2～3天觀察成瘤情況，將P0代移植瘤取出后再次接種于裸露皮下生長的腫瘤為第1代(P1)。待裸鼠皮下腫瘤生長至500 mm3，裸鼠經(jīng)CO2窒息處死，取出腫瘤組織，重復(fù)上述方法，傳代至第2代(P2)，取部分P0、P1、P2代腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，進行HE染色并與食管癌患者腫瘤組織進行比較。

1.2.4 PDX模型生長曲線 隔日觀察腫瘤體積及小鼠體重變化，腫瘤體積計算公式為V=(D×d2)/2(D為腫瘤表面最長徑，d為腫瘤表面最短徑)，繪制生長曲線。

1.2.5 組織鑒定和HE染色，傳代 將食管癌患者取出的腫瘤組織即初代(P0)以及移植瘤P1，P2代用多聚甲醛固定后，石蠟組織包埋，連續(xù)厚度6 μm組織切片并HE染色，嚴格按照HE染色試劑盒進行染色流程。光鏡下觀察比較病理形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤大體表觀形態(tài) 3名食管癌患者腫瘤組織接種裸鼠皮下后，均生長出近似于球形的移植瘤(P0代)。將其中1名患者P0代移植瘤取出后，再次接種于3只裸鼠皮下，大約1個月后，又生長出比P0代更近似于球形的移植瘤(P1代)。P0代與P1代具體移植瘤大體表觀態(tài)見圖1。P0代與P1代移植瘤表觀形態(tài)無明顯差異。

圖1 移植瘤大體表觀形態(tài)觀察

2.2 食管癌PDX模型移植瘤生長情況 食管癌PDX模型P0代移植瘤生長較慢，第10天時裸鼠皮下才出現(xiàn)肉眼可見的小包，第20天時小包長成綠豆大小(直徑約為0.3 cm)，第30天時長成黃豆大小(直徑約為0.5 cm)，第40天時已長成明顯的移植瘤。對食管癌PDX模型P0代、P1代和P2代移植瘤的瘤體體積進行測量，繪制生長曲線。見圖2A、2B和2C。以瘤體體積達到500 mm3時所需的天數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，P0代移植瘤達到500 mm3時，約需要60 d；P1代只需要不到40 d；而P2代只需要20 d左右(圖2D)。隨著食管癌PDX模型移植瘤的傳代，瘤體的生長速度明顯加快。

2.3 食管癌PDX模型移植瘤HE染色光鏡觀查結(jié)果 通過HE染色，觀察比較食管癌PDX模型移植瘤病理形態(tài)變化。結(jié)果顯示，P0代、P1代、P2代移植瘤光鏡下組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似，沒有出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變(圖3)。

A：P0代移植瘤生長曲線；B：P1代移植瘤生長曲線；C：P2代移植瘤生長曲線；D：瘤體體積達到500 mm3時所需的天數(shù)注：與P0代比較，**P<0.01圖2 PDX模型移植瘤生長情況

圖3 食管癌PDX模型移植瘤HE染色光鏡觀查結(jié)果

3 討論

PDX模型的構(gòu)建成功與否與原發(fā)腫瘤的惡性程度、移植小鼠的類型、移植部位等因素有關(guān)[6]。相關(guān)文獻報道，卵巢癌腎包膜移植PDX SCID小鼠(T,B細胞均缺陷)模型成功率高達95%[7]，非小細胞性肺癌皮下移植PDX SCID小鼠模型成功率為45%[8]，而乳腺癌皮下移植PDX模型僅為13%[9]。本研究采用T細胞缺陷的裸鼠，裸鼠右腋下接種，食管癌PDX模型構(gòu)建成功率較高。由于食管癌PDX模型相關(guān)報道較少，其應(yīng)用價值較高。

本研究選用3名臨床食管癌患者，且全部癌組織均能在裸鼠皮下成瘤。P0代成瘤周期約為60 d(以腫瘤體積達到500 mm3為標準)，P1代為40 d，P2代為20 d。隨著傳代次數(shù)增加，其成瘤速度加快。這一結(jié)果與頭頸部鱗狀上皮細胞癌PDX模型和涎腺腺樣囊性癌PDX模型構(gòu)建相似[10]。

以往的研究表明，腫瘤PDX模型在病理組織結(jié)構(gòu)、基因譜表達水平、基因的拷貝數(shù)均與原移植瘤保持高度的一致性[11]。在本研究中，除了建立起食管癌的PDX移植瘤模型，還比較它們轉(zhuǎn)代后的生長速度。為了檢驗食管癌PDX模型在生長過程中是否會出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化，我們做了HE染色，觀察比較病理形態(tài)變化。結(jié)果顯示，隨著食管癌的傳代，未發(fā)現(xiàn)病理組織形態(tài)學(xué)的改變，證實了食管癌PDX模型保持了原發(fā)腫瘤的病理組織結(jié)構(gòu)。構(gòu)建的食管癌PDX模型有利于快速研究人原發(fā)食管癌相關(guān)特性。

PDX模型可用于精準醫(yī)療中，建立腫瘤患者個性化的PDX模型有利于開展體內(nèi)實驗，實現(xiàn)以患者腫瘤基因為靶向的治療策略[12]。但目前仍存在諸多問題，如連續(xù)傳代出現(xiàn)原發(fā)腫瘤特征丟失的問題[13]，需要進一步解決。