水蛭膠囊薄層鑒別及次黃嘌呤含量測定的研究

劉明智 黃光磊 張鈺祺 易徐航 袁娟麗

摘要：目的 建立水蛭膠囊薄層鑒別及次黃嘌呤含量測定方法。方法 采用薄層色譜法以水蛭對照藥材對水蛭膠囊進行定性鑒別；以高效液相色譜法對其中的次黃嘌呤進行含量測定：采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水（5：95）為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果 水蛭膠囊供試品的薄層色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，可以作為水蛭膠囊的鑒別方法；高效液相色譜法中，次黃嘌呤的進樣濃度在2.67-85.40μg·mL-1（r =1.0000）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；次黃嘌呤的平均回收率（n=6）分別為98.3%（RSD%=0.5）；5個批次水蛭膠囊樣品中次黃嘌呤的含量測定結(jié)果分別為100.0μg/袋，104.7μg/袋，97.6μg/袋、101.5μg/袋、103.7μg/袋。結(jié)論 本文建立的方法經(jīng)方法學驗證，結(jié)果準確、可靠，可用于評價水蛭膠囊質(zhì)量。

關(guān)鍵字：水蛭膠囊，薄層色譜法，高效液相色譜法，次黃嘌呤，含量測定

[ABSTRACT] Objective To establish a qualitative identification method and a HPLC method for the determination of hypoxanthine in Shuizhi Capsule.Methods TLC was employed to make qualitative identification of Hirudo in Shuizhi Capsule and HPLC was used to determine the content of hypoxanthine in Shuizhi Capsule：The analytical column was Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm），methanol-water（5：95）as mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min and the detection wavelength was 254nm，The column temperature was 25℃.Results The spot in the chromatograms of Shuizhi Capsule were in the same location and color with those in the chromatograms of standard hirudo and the result showed that the method has good durable ability.The linear range for hypoxanthine was 2.67-85.40μg·mL-1（r =1.0000）. The average recoveries（n=6）were 98.3%（RSD%=0.5）for hypoxanthine.The contents in 5 sapmles of Shuizhi Capsule were 100.0μg/bag，104.7μg/ bag，97.6μg/ bag、101.5μg/ bag、103.7μg/ bag.Conlusion The method is accurate and reliable，and it can be applied to the quality control of Shuizhi Capsule.

[Key words] Shuizhi Capsule；TLC；HPLC；hypoxanthine；determination

水蛭最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是一味具有強效破血逐瘀的蟲類藥，對血液動力等方面有積極的改善作用[2-3]。因其療效確切，為歷版《中國藥典》所收載[4]。《中國藥典》收載的水蛭為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蟥Whitmannia acranulata Whitman的干燥全體[5]。水蛭含有多種有效成分，主要含有兩類：一類是以水蛭素為代表的多肽及蛋白類大分子成分；另一類是蝶啶等小分子化學成分[6]。水蛭“夏、秋二季捕捉，用沸水燙死，曬干或低溫干燥[5]。”但水蛭素在80℃條件下15min能將其破壞[7]，即水蛭飲片中水蛭素已被破壞。次黃嘌呤是水蛭所含的有效成分之一，是核酸的代謝產(chǎn)物，廣泛存在于動植物中，具有平喘、舒張支氣管、降壓等藥理作用，其作為有效成分指標測定其含量的研究廣泛[8-9]，已有報道測定水蛭飲片中次黃嘌呤的含量[10]。水蛭膠囊為醫(yī)療機構(gòu)制劑，為單方制劑，其質(zhì)量標準由江西省食品藥品監(jiān)督管理局頒布，標準號為GZJ-0296-（1）-2006，其正文內(nèi)容并無鑒別方法和含量測定方法。本文對水蛭膠囊采用薄層色譜法（TLC）進行了定性鑒別、采用高效液相色譜（HPLC）法對其主要成分次黃嘌呤進行了含量測定。方法簡便易行，結(jié)果準確可靠，建立了水蛭膠囊的質(zhì)量控制的有效方法，也為含水蛭成方制劑的質(zhì)量研究提供了重要參考。

1儀器與試藥

1.1儀器：1200高效液相色譜儀（美國安捷倫）；ME-204萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）；CP225D十萬分之一電子天平（賽多利斯）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）。

1.2 試藥：水蛭中藥材對照品（中國食品藥品研究檢定院，批號：121061-201305）；次黃嘌呤（中國食品藥品研究檢定院，批號：140661-200903，含量：99.5%）；水蛭膠囊樣品（五批，萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院制劑室提供，批號分別為：20150704；20150103；20160611；20170102；20170904）；薄層層析硅膠G（產(chǎn)地：東洋化工有限公司分廠，批號：0140121）；乙腈（HPLC級，購于北京百靈威科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2方法及結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別水蛭膠囊中水蛭

取水蛭對照藥材細粉lg，加乙醇5ml，超聲處理15min，濾過，取濾液作為對照品溶液。取本品內(nèi)容物粉末lg，同法制成供試品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版第四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液和對照品溶液各5μ1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點顯色清晰。。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點；紫外光燈（365nm）下顯相同的橙紅色熒光斑點。

2.2 HPLC法測定水蛭膠囊中水蛭含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）柱，以甲醇-水（5：95）為流動相，檢測波長為254 nm；流速：1.0 ml/min，柱溫：25 ℃，進樣量10μl。理論塔板數(shù)按次黃嘌呤峰計算，不得低于3000。

2.2.2 溶液的制備（1）對照品溶液 取次黃嘌呤對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含10μg的溶液，作為對照品溶液。（2）供試品溶液 取裝量差異項下本品內(nèi)容物，混勻，研細，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，25kHz）60min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，為供試品溶液。

2.2.3. 專屬性試驗

取次黃嘌呤對照品，按2.2.2項下對照品溶液的制備方法制備對照品溶液和供試品溶液。精密量取上述兩種10μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖。對照品溶液和供試品溶液中，主峰對稱因子以及與其他雜峰分離度均符合規(guī)定，理論踏板數(shù)按照次黃嘌呤計為22416。色譜圖見圖1。

2.2.5 線性范圍考察

取次黃嘌呤對照品適量，精密稱定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取適量，用甲醇稀釋至濃度為2.67、5.34、10.48、21.35、42.70、85.40μg/ml的溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10μl注入液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標，相應的峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程Y=0.0223X+0.0718，r =0.9999，線性范圍為26.7μg～854.0μg。

2.2.6 系統(tǒng)精密度試驗

精密吸取次黃嘌呤對照品溶液10μl，按2.2.1項下色譜條件重復進樣6次，測定峰面積，計算次黃嘌呤峰面積的RSD為0.2%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗

取同一批號樣品（批號：20160611）共6份，精密稱定，按2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，按照2.2.1項下測定次黃嘌呤的含量，計算得次黃嘌呤含量分別為98.2μg /粒、97.7μg /粒、97.5μg /粒、98.7μg /粒、98.1μg /粒、98.0μg /粒，RSD為0.4%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：20160611），室溫保存，按2.2.1下色譜條件，分別于0、2、4、8、12h精密吸取10μl進樣，測定次黃嘌呤的峰面積，峰面積的RSD為0.3%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收實驗

取本品（批號：20160611）適量，精密稱定，分別加入取次黃嘌呤適量，精密稱定，按2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備同一濃度（相當于100%濃度水平）供試品溶液共6份，精密取10μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖；另取次黃嘌呤對照品，按2.2.2項下對照品溶液的制備方法制備對照品溶液，同法測定。記錄色譜圖，計算回收率。可接受的回收率應在90～110%，本品含量測定的平均回收率為98.3%，RSD=0.5%，表明含量測定方法的回收率良好，測定結(jié)果見表1。

2.2.10 樣品測定

取裝量差異項下本品內(nèi)容物，混勻，研細，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，25kHz）60min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，精密取10μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖；另取次黃嘌呤對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含10μg的溶液，作為對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算，既得。記錄色譜圖，量取峰面積，按外標法計算樣品的含量。三批樣品的含量測定結(jié)果見表2。

3 討論

《中國藥典》2015年版一部水蛭中藥材及其飲片的含量測定法采用的是生物測定法[5]，所需的凝血酶試劑價格昂貴且不易保存，且檢測時操作稍復雜。次黃嘌呤相對穩(wěn)定，提取方法相對簡單 [11]，其廣泛存在于動植物中。本文采用薄層色譜法對水蛭膠囊進行定性，結(jié)合高效液相色譜法對其主要成分次黃嘌呤的含量進行測定，可有效控制水蛭膠囊的質(zhì)量。

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