分子技術在流感病毒檢測中的應用探討

陳小青

【摘? 要】流行性感冒是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，流感病毒具有流行與不斷復制重組的能力，不但傳染性極大，傳播速度也非常快，使得流感成為整個世界公共衛生的重大威脅。近年來，全球范圍內流感頻頻爆發，快速控制并治療流感的需求，要求對每一種流感病毒都能夠快速檢測的出來，而具有檢測速度快，檢測靈活敏感，并且特異性高的分子檢測技術對預防與控制流感的傳播和實驗室檢測工作而言，異常重要。

【關鍵詞】分子技術;流感病毒;檢測;

【中圖分類號】R372????? 【文獻標識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）01-0294-02

流行性感冒主要由流感病毒感染引起，具有高傳染性，且可以通過空氣、污染物與人際接觸傳染，傳播速度極快。感染了流感病毒后，往往很快就出現發熱、高燒、全身乏力、疼痛等癥狀，并且呼吸道會出現病征，尤其是老年、嬰幼兒與存在心肺疾病的患者極易并發肺炎等重病，甚至導致死亡，具有巨大的破壞性。流感病毒由分節段的單負鏈RNA組成基因組，根據其核蛋白（NP）和膜蛋白（MP）的不同，可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三種類型，尤其是甲型流感病毒易發生抗原變異，傳染性大，非常容易造成大規模流行性疾病[1]。甲型流感病毒根據抗原的不同還分為9個NA亞型與16個HA亞型，這兩種亞型抗原又可以通過轉換形成新的亞型，而亞型新病毒極可能出現并引發更大型的流行性流感。因此，能否快速、精準的檢測出流感病毒對于治療與控制流感病毒的傳播與疫情十分重要。分子生物學的快速發展，使得分子技術的應用日益廣泛，在流感病毒的檢測中也發揮這非常重要的作用。

1 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應（PCR）對流感病毒的檢測主要是通過在非常短暫的時間里增加大量的特定DNA片段來實現的分子生物學檢測技術，聚合酶鏈反應在進行病毒檢測時僅僅需要少量的樣本就可以實現檢測，且其重復性好，檢測速度快、敏感高效，從收集樣本到最終檢測出結果最少需要2小時，最多需要24小時即可。

聚合酶鏈反應法包括普通RT-PCR法、多重RT-PCR法與實時熒光定量法，其中，普通RT-PCR法主要是對NA基因片段與HA基因片段進行檢測，目前對未知流感病毒的基因片段進行兼并引物來進行擴增，進而達到分型的目的。多重RT-PCR法則可以一次只對一種病毒進行檢測，也可以同時對多種病毒進行檢測，但需要應用多對引物組合進行分型檢測。其同樣具有高度的靈敏度與特異性，檢測高效，同時檢測多種病毒成本更低，更適用于臨床檢測應用中。實時熒光定量檢測法指將熒光基因加入到聚合酶鏈反應體系中，通過熒光信號在檢測過程中的實時積累來進行檢測，并以此來展開定量分析。該方法不但具有普通聚合酶鏈反應方法的強特異性、高度敏感、具有重復性等優點，同時由于熒光因子能夠更直觀的檢測到，大幅度降低了檢測到假陽性的可能性[1]。

2 依賴核酸序列的擴增法（NASBA）

依賴核酸序列的擴增法的檢測靈敏度與特異性都比聚合酶鏈反應檢測的高，且其擴增的效率更高，操作也相對簡單，然而，該法在檢測前必須優化引物，且在病毒檢測中還存在某些病毒出現假陽性或靈敏度不足的現象。它主要由一對引物進行引導，以及一種連續的均一的特異單鏈RNA做恒溫的擴增產生反應的過程。依賴核酸序列的擴增法應用廣泛，多應用于禽流感病毒檢測、呼吸道病毒檢測中，目前，醫學研究界已經對NASBA檢測技術進行改進，現在的NASBA檢測技術已經可以實現實時檢測，能夠定量檢測，使其檢測的特異性與靈敏性大大提高，目前已廣泛應用于A、B兩型流感病毒、呼吸道病毒的檢測，能夠快速分離出乙型、H3N2、H1N1流感病毒。

3 環介導等溫擴增法（LAMP）

環介導等溫擴增法（LAMP）簡單的說就是一種擴增核酸的方法，通過應用4種具有特異性的引物，聯合DNA聚合酶置換作用，在恒溫狀態下，對靶基因的多個區域進行核酸擴張。該法的可操作性強、簡單，也不需要特定的試劑與儀器，LAMP只有兩種結果，一是擴增，二是不擴增，只需要查看反應物染色后的顏色以及試劑的渾濁程度就能夠進行結果判定。目前，LAMP技術已非常成熟，以及研發出了多種針對性強的檢測技術，比如針對新甲型H1N1流感病毒檢測的技術、針對季節性流感病毒的檢測技術以及針對H3N2病毒的檢測技術等。

4 基因芯片

基因芯片（genechip）（又稱DNA芯片、生物芯片），其測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針[2]。通過探針與樣品進行雜交，再通過對雜交信號進行檢測來判斷生物樣品數量的多少。基因芯片檢測的穩定性高，具有良好的重復性與并行性，檢測速度快，效率高，唯一缺陷是其操作繁瑣，尤其對檢測設備等條件的要求很高，難以適用于一般實驗室的病毒檢測，但用于調查流行病學與開展醫學科學研究卻效果顯著。

近年來，分子生物學的研究取得了長足的進步，對流行感冒病毒的檢測技術也更加成熟與多樣了。本文主要介紹了聚合酶鏈反應檢測法、依賴核酸序列的擴增法、 環介導等溫擴增法與基因芯片檢測技術，此外還有納米技術、核酸探針技術、基因測序技術、原位雜交技術、質譜技術等[3]。但目前我國在預防與監控流感病毒上，應用得最多的還是聚合酶鏈反應檢測法，其他檢測方法較少使用，但隨著分子技術的研究更加深入，檢測技術與條件的更加完善，我國也將加大其他檢測技術在日常流感病毒的預防檢測工作中的應用，同樣，這些技術也將在流感病毒防控工作中發揮重要作用。

參考文獻

[1]?? 劉鳳.分子技術在流感病毒檢測中的應用[J].現代預防醫學，2014，41（12）：2249-2251.

[2]?? 李勃，孫菲，李文悌，王曉春.分子技術在流感病毒診斷中的應用[J].檢驗醫學與臨床，2011，8（16）：1992-1994.

[3]?? 于新友，李天芝，莫玲，沈志強.分子生物學技術在鴨坦布蘇病毒檢測中的應用研究進展[J].水禽世界，2015（04）：36-39.