代謝組學技術在獸藥違規使用監測中的應用及研究進展

郭旭茜 韓雪 李研東 蔡英華 于雷 康牧旭 艾連峰

摘 要：獸藥殘留分析檢測技術的開發與創新是動物源性食品安全監測的重要研究內容。作為系統生物學的重要組成部分，代謝組學研究及其檢測技術在動物源性食品安全領域發揮了不可或缺的作用。基于當前代謝組學技術在獸藥殘留檢測領域的研究成果，闡述了代謝組學的概念、原理與分類;以“瘦肉精”和類固醇兩類違禁獸藥殘留檢測為例，簡述了液相色譜串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS）、氣相色譜串聯質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry， GC-MS）等代謝組學常用檢測技術對動物血液、尿液等生物樣本進行殘留分析檢測的應用現狀，分析了非靶向代謝組學與靶向代謝組學存在的精確度差與通量低等問題，以及代謝組學技術對大型儀器設備與專業數據庫過度依賴的局限性;進一步提出了代謝組學技術在獸藥殘留檢測的應用中應根據樣品特點及檢測目的，將多技術平臺（液相色譜-電噴霧飛行質譜、超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜）、分析平臺（主成分分析、偏最小二乘判別分析）與多組學技術（基因組學、轉錄組學、蛋白組學）聯合使用以提高代謝組學技術在獸藥殘留檢測領域的適用性與應用范圍，為獸藥殘留分析檢測提供新的研究方向。

關鍵詞：食品檢驗學;代謝組學;獸藥殘留;食品安全;檢測

中圖分類號：Q591.1?文獻標志碼：A

文章編號：1008-1542（2019）04-0359-07

近年來全球范圍內食品安全事件層出不窮，對人類的身體健康以及食品產業發展產生了嚴重的不良影響，如新西蘭恒天然肉毒桿菌、巴西的“黑心肉”以及中國的瘦肉精、三聚氰胺事件等。在常規食品分析檢測中， 質譜、光譜、色譜以及其他一些儀器分析方法對已知目標物質的檢測結果是較準確的[1]，但在某些特殊情況下，這些有針對性的方法不能檢測到該類物質或新代謝產生的化合物[2-3]，且動物源性食品的獸藥殘留檢測常存在獸藥殘留濃度較低，同時測定抗生素[4-5]、受體激動劑[6]、類固醇[7]等不同性質的獸藥會較困難等，因此亟需開發新型的檢測方法和策略來解決這一技術難題。

代謝組學（metabonomics）是研究受刺激或擾動后的生物體系（細胞、組織或生物體）代謝產物的變化或其隨時間變化的一門科學，目的是分析生物系統內所有代謝物的含量[8]。1999年英國倫敦大學帝國學院的 NICHOLSON 教授首次定義了代謝組學[9]， 它與基因組學、蛋白質組學、轉錄組學共同構成了“系統生物學”[10]。代謝組學技術能從小分子的角度來分析生物體系，在目標物質的分析方面具有獨特的優勢，近年來迅速發展并滲透到食品、中醫藥、農業、林業、畜牧業等多種領域，并發揮了不可替代的作用[11-12]。

代謝組學可以對已知的化學物質進行分析， 又能對未知化學物質進行分析，根據研究的目的和對象的不同，可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學;靶向代謝組學和非靶向代謝組學皆可用于研究獸藥的代謝機制，靶向代謝組學針對的是特定的某一類代謝物，用于少量目標代謝物檢測，關注目標通路代謝物，是絕對定性定量的，而非靶向代謝組學面對的是生物體內源性的整體代謝物全面檢測，尋找潛在生物標志物，其操作簡單，且非靶向檢測代謝物通量高，發現新標志物的幾率大。因此近些年來， 國內外一些學者陸續將代謝組學技術應用于食品安全領域，例如檢測獸藥殘留，對摻假食品進行分析鑒別[13-14]，檢測食品或食品包裝材料中的有害物質[15]等，靶向和非靶向代謝組學技術可表達出生物標志物與違禁添加的獸藥之間的關系， 從而可作為指示物為相關預警監督提供一個平臺[2，16]。

代謝組學作為一種新型的藥物監控檢測技術，可用來解決食品安全問題，為人類健康生活提供更好的保障。

通過總結、分析和討論代射組學在獸藥違規檢測中的應用現狀，為進一步應用代謝組學技術、開展食品安全風險監測與評估提供一定的參考[17]。

1?瘦肉精及其代謝產物的代謝組學分析

瘦肉精，即克倫特羅（clenbuterol，CLE），屬于β-受體激動劑，臨床上最初用來治療哮喘、阻塞性肺炎等疾病;與之作用機理相似的還有萊克多巴胺（ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（salbuterol，SAL）、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅、鹽酸多巴胺等多種β-受體激動劑類藥物，均可顯著提高胴體瘦肉率和飼料轉化率[6]，近年來，包括中國在內的許多國家都出現食用β-受體激動劑殘留產品而發生食物中毒的事件。中國針對瘦肉精的檢測設置了一些標準，常用液相色譜串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）進行動物組織中沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅等殘留量的檢驗[18-21]，但是常規檢測技術對某些禁用藥物的新化合物或者低劑量聯合使用往往無法檢測出來[22]，需進行更嚴格的監督檢測來保障動物源食品安全，代謝組學技術可用來檢測這一類藥物的生物標志物，進而可有效幫助監測該藥物的非法使用情況[22-31]。

近年來研究人員陸續將代謝組學技術應用于違規使用瘦肉精而殘留于動物體內的檢測，雖檢測過程有些不同，但皆證明了代謝組學技術在獸藥殘留檢測方面的可行性以及可靠性，例如以2-吲哚甲酸作為生物標志物有助于對瘦肉精的濫用情況進行監測。因為服用瘦肉精后動物體內代謝水平會發生變化，通過識別異常代謝物水平，可找出潛在的生物標志物，對其進一步鑒定分析后可幫助了解瘦肉精在動物體內詳細的代謝機制，進而對瘦肉精的濫用情況進行監測[28，30]，瘦肉精在牛體內已知的主要代謝途徑如圖1所示[25]。

DERVILLY-PINEL等[23]研究β-受體激動劑（β-agonists）對牛尿液代謝的影響，發現代謝組學技術可通過生物標志物和統計模型來監測動物體內是否使用β-受體激動劑，并利用生物矩陣分析揭示藥物的生物效應;DOMNGUEZ-ROMERO等[24]利用液相色譜-電噴霧飛行質譜法（liquid chromatography electrospray time-of-flight mass spectrometry，LC-TOF MS）檢測大鼠單次給藥后，克倫特羅、特布他林和沙丁胺醇的尿代謝產物情況，經鑒定共發現11種代謝產物，其中有4種未出現在以前尿液報告中。

畢言鋒[25]應用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法（ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）研究β-受體激動劑在豬體內的代謝規律， 在監控苯乙醇胺A（phenyletiianolamine A，PEAA）非法使用時， 發現脫甲基代謝產物（demethylation-phenyletiianolamine A，DM-PEAA）更適合作為尿液和組織中的殘留檢測的目標物，為選擇殘留檢測標志物和建立殘留分析方法提供了一定參考;吳玉蘋[28]對使用β2-受體激動劑的豬尿進行分析，證實篩選出的共同差異代謝物2-吲哚甲酸和氟米龍醋酸酯在β2-受體激動劑監測的時效上是可行的;谷旭等[29]在豬尿液和血漿中檢測出5種沙丁胺醇的代謝產物，其中2種尚未見文獻報道，血漿中僅檢測到原型藥物和2種代謝物;WU等[31]分析了服用由3種低劑量β2-激動劑混合物組成的“雞尾酒”后豬尿液的特征，結果檢測到的2-吲哚甲酸和氟甲氧基乙酸生物標志物無論是單次還是混合物都可作為檢測β2-激動劑非法使用的診斷標志物，證明了利用標記物監測β2-激動劑是可行的。

2?類固醇及其代謝產物的代謝組學分析

類固醇激素，又稱甾體激素，蛋白質同化作用強烈持久，能促進動物超常態生長，可為養殖戶帶來巨大的經濟效益，因而在養殖業中被大量使用[9]。但是，濫用該類激素會導致在動物組織中產生不同程度的殘留，會導致機體代謝紊亂、發育異常甚至存在潛在的致癌、致畸風險。外源性類固醇是已知的類固醇，如替尼博龍，包含合成化學結構，被認為是非自然的，對其的檢測只需進行定性的證明;內源性類固醇，如睪酮，黃體酮，含有已知的自然存在的結構，對其的檢測更為復雜。

中國設立的國家標準中常采用液相色譜串聯質譜法（LC-MS）檢測動物源食品中激素的殘留量[32-34]，雖然在過去十年中，從氣相色譜串聯質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）到液相色譜串聯質譜法（LC-MS），藥物殘留分析技術領域已經有了許多轉變，但GC-MS仍是分析飽和甾體代謝物的重要工具[35]，因為在LC-MS的電離條件下，飽和甾體化合物通常會受到電離性差的影響。高分辨率、高精度液相色譜質譜（liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）可顯示出卓越的質量穩定性，可同時監測大量分析物，實現實時或回溯性的監測[36]。雖然沒有一種方法能夠檢測到所有物種中所有內源性類固醇的濫用情況，但代謝組學技術在類固醇監測領域內已取得了重大進展[37-46]，類固醇類激素的代謝通路如圖2所示[47]。

DERVILLY-PINEL等[37]研究發現了類固醇給藥后動物尿液中代謝組的改變狀況，此研究突出了對生物標志物的針對性監測，可為合成代謝類固醇藥物的篩選開辟新的研究思路;NZOUGHET等[38]利用LC-HRMS方法，首次以血清為樣本類型，研究服用雌二醇后牛血清中的代謝水平變化，產生了結合一組選定標記強度的篩選模型，此研究首次表明血清代謝組學在檢測牛的合成代謝濫用方面具有重要作用;REGAL等[39]利用LC-HRMS為基礎的代謝組學方法研究了使用雌二醇/孕酮后的奶牛血清中代謝組的變化，其建立預測模型后可用來幫助檢測牛體內是否非法使用這些激素，還找到了雌二醇/孕酮的潛在生物標志物，但其具體結構有待闡明。

ANIZAN等[40]研究類固醇類激素在牛體內的代謝情況，用全掃描模式研究尿代謝物的尿液曲線，篩選出了2種生物標志物5α-雄甾烷-3β，17α-二醇和5α-雄甾烷-2-烯-17-酮，可用于篩查牛體內類固醇的濫用情況;REGAL等[44]利用LC-HRMS系統對用雌二醇-17β處理的奶牛和對照動物的血清樣本進行了代謝組學研究，發現有一個潛在的生物標志物在結構上被解釋為二肽，并通過檢測來測試其有效性，它已經被證實也在雌二醇處理動物的其他樣品中;ANIZAN等[45]研究了雄烯二酮對牛尿液中二期甾體結合物代謝產物的影響，發現在被處理的動物樣品中3-硫酸表柔酮濃度的變化有異常。

3?存在問題及局限性

代謝組學方法針對的是藥理活性而不是單個的藥物結構，應用組學方法的原理不是直接檢測藥物的存在，而是通過靶向或非靶向方法來檢測其在動物體內的累積生物效應，它們產生并篩選數據，可用來表明是否可能發生了藥物濫用情況。從生物學角度理解，代謝組學針對的是一個完整的生物體系，而不是針對單獨一個細胞，對整體隨時間改變而發生的代謝全過程進行檢測、鑒別和分類[46]。

但是代謝組學研究本身是存在缺點的，要求非靶向代謝組學準確鑒定代謝物是很難的，且其靈敏度不夠精確，對低豐度代謝物檢測率低，其數據分析需要依賴公共數據庫;同樣，靶向代謝組學的研究也存在很多局限，其研究需要標準品，需要提前構建標準曲線，且通量低，所以對于一些未知物的檢測是有一定限制的。

代謝組學技術分析手段有限，沒有一種分析技術能夠同時分析所有的代謝組，只能選擇性的選取多種技術來進行并行分析;代謝組學所用的儀器設備價格昂貴，需要專業性很強的技術人員來操作;代謝組學研究會得到海量數據，處理復雜且耗時較長。在獸藥檢測的應用方面，同樣存在缺陷與不足，代謝組學對于獸藥檢測的數據庫到目前為止還不夠完整;另外，生物體本身的代謝受體內外各種因素條件的干擾，會導致樣本的較大差異性，有些條件難以控制會導致結果的低可信度[27，46];而且目前代謝組學應用于獸藥研究的數據量還較少，導致研究結果可能會存在較大的偏倚。

4?展?望

代謝組學技術作為組學領域內的新興學科，在食品安全領域，尤其是在動物源性食品的獸藥檢測中具有很好的應用前景，為食品質量與安全研究提供了新的方法、思路和依據。

系統代謝產物在各個生物體系中相類似，因此代謝組學技術的應用研究更具有普遍意義。相對于其他組學來說，基因和蛋白質表達微小有限的變化可通過相應代謝產物表達而放大，令分析檢測更為容易。代謝產物分布廣，性質差異較大，單靠一種分析手段難以進行無偏向性的全面分析。LC-MS技術、GC-MS技術以及以它們為基礎的各種更高水平的技術平臺，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLSDA）等各種統計學分析平臺，皆可為代謝組學技術提供不同角度的支持。因此，要根據所研究樣品的特性及研究目的來選擇方法，并綜合利用技術平臺和分析平臺，以求得到更詳盡的分析結果。

憑借代謝組學獨特的視角研究獸藥的代謝機制，利于尋找有價值的特異性標志物，可為獸藥監測評估提供依據，在未來的應用研究中，可利用各種現代分析檢測技術手段以及數據統計分析技術的互補聯用作用，建立大規模的標準化的代謝組學數據庫;隨著高新技術的不斷涌現，基因組學、轉錄組學、蛋白組學及代謝組學的多層組學整合分析是未來精準檢測分析的發展趨勢。通過對多組學的聯合分析，可對生物體進行系統性研究，能夠快速簡便地獲得更全面、準確的代謝信息。對代謝組學的研究方法進行不斷的完善和更新，建立更加精確的系統分析方法，可為確保食品質量與安全、預防和減少食源性疾病發生概率提供重要技術支持，特別是對中國食品安全風險監測與評估等工作具有非常重要的現實意義。

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