粳稻種質資源苗期耐鹽相關性狀的SSR標記關聯分析

謝菲菲，田普江，馬帥國，白天亮，陳靜茹，張 倩，田蓉蓉，楊治偉，田 蕾，李培富

(寧夏大學 農學院/寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

在世界范圍內鹽堿土分布十分廣泛，總面積已達10億hm2[1-2]。我國鹽堿土面積龐大[3]，分布廣泛，鹽漬化土壤面積為3.6×107hm2[4]，耕地鹽漬化比例達6.62%[5]。近年來，隨著氣候變暖及化肥的大量施用、不合理灌溉等農業措施的影響，我國農業用地鹽堿化程度不斷加劇[6-7]，嚴重影響了鹽漬土地區農業生產的發展。

土壤鹽漬化是危害水稻生產的重要非生物脅迫之一[8-10]。水稻(OryzasativaL.)是全世界1/2以上人口的主食來源[11]，也是我國主要的糧食作物之一，屬于鹽敏感作物。當土壤EC值達到3 dS/m時,水稻即表現出受害癥狀，最終導致顯著減產[12]。水稻在幼苗期對鹽脅迫最敏感[13]。因此，如何提高水稻苗期耐鹽性，已成為培育耐鹽水稻品種、增加鹽漬土條件下水稻產量、充分利用鹽漬土資源的關鍵。

眾多研究表明，水稻苗期耐鹽性是受多基因控制的復雜數量性狀[14-22]。前人采用連鎖分析方法結合各種類型的遺傳群體定位了許多控制苗期耐鹽相關性狀的QTL，主要包括提高水稻耐鹽級別[7,19-22]、延長鹽脅迫下水稻幼苗存活天數[16,22]、增加株高[11,17,21]、提高植株干鮮質量[7,17,21]、增加地上部和根中的K+含量[15-16,18,21-22]、減少Na+含量[16,18,21-22]、提高鉀鈉比[11,18,21]的QTL。關聯分析是檢測QTL的另一種主要方法，利用覆蓋全基因組的分子標記獲得關聯群體的基因型，并與目標性狀進行關聯分析，掃描引起表型變異的位點。與連鎖分析相比，關聯分析不需要構建特殊的作圖群體，可同時檢測相同基因座上的多個等位基因，提供更加豐富的等位變異[23]。近年來，關聯分析已廣泛應用于水稻農藝性狀[24-26]、產量性狀[26]、抗稻瘟病[27]基因位點的發掘。在水稻耐鹽相關性狀關聯位點的研究中，ZHENG等[28]利用341份粳稻種質資源結合SSR標記，檢測到4個控制幼苗存活天數和8個控制地上部鉀鈉比的關聯位點；KUMAR等[29]在大田條件下評價了220份水稻種質資源的耐鹽性，利用基因芯片技術檢測到多個在鹽脅迫下控制單株產量、有效分蘗數、結實率和鈉鉀比的關聯位點。本研究在前人的基礎上，選用38對均勻分布在水稻全基因組的SSR標記對160份粳稻種質資源進行檢測，分析多個水稻苗期耐鹽相關性狀與SSR標記的關聯性，以期為水稻苗期耐鹽相關位點的發掘、耐鹽優異親本的選擇及后代標記輔助選擇提供理論支持和材料保障。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

160份粳稻種質資源由寧夏大學農學院遺傳育種實驗室李培富教授提供，其中，中國124份、阿爾巴尼亞1份、朝鮮3份、韓國4份、法國1份、南斯拉夫1 份、葡萄牙2份、日本21份、俄羅斯1份、意大利1份、幾內亞1份(表1)。

表1 160份粳稻種質資源名稱及來源

續表1 160份粳稻種質資源名稱及來源

續表1 160份粳稻種質資源名稱及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻苗期耐鹽性評價 試驗分別于2017、2018 年7 月在寧夏大學實訓基地日光溫室內進行。參照田蕾等[30]的方法培養粳稻幼苗，并分析耐鹽相關性狀。于種子萌發的第15 天，設對照組和鹽脅迫組(含125 mmol/L NaCl)2 個處理，每處理3個重復，每個重復24株。于脅迫的第6天測定各種質的耐鹽級別、葉片傷害百分率(鹽脅迫下水稻葉片的電導率大于CK葉片的電導率時，葉片表現為受傷害)、苗高、根長、莖粗、地上部鮮質量和根鮮質量，計算根冠比以及除耐鹽級別和葉片傷害百分率之外各指標的相對值(處理指標值/CK指標值)。

1.2.2 DNA的提取及SSR分子標記檢測 參照ZHENG等[28]的方法，提取各粳稻種質葉片總DNA，選取均勻分布在水稻全基因組的38對SSR引物對160份粳稻種質資源進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.3 數據處理分析

試驗數據用Excel 2010軟件進行整理和計算，利用SPSS 19.0軟件進行相關性分析。

每對SSR引物代表1個位點，將每條擴增條帶視為1個等位變異，有條帶記為1，無條帶記為0，缺失記為9，建立0-1矩陣，按照不同軟件要求進行數據應用格式的轉換。參照馬翠蘋等[31]的方法，利用Popgene軟件計算Shannon’s信息指數和Nei’s遺傳多樣性指數。

利用Structure 2.2軟件的等位變異發生頻率非相關模型和混合模型[32]分析群體結構。亞群數設為2～8個，每次運行的不作數迭代和重復次數均設置為50 000次。每個參數運行5次，以最大似然值△K為標準選取最佳的亞群數。根據相似性最大的運算結果劃分組群，后驗概率Q≥0.6的種質被劃分到相應的組群中，后驗概率Q<0.6的種質被劃分到混合組群。

使用Tassel 2.1軟件的一般線性模型(GLM)進行關聯分析[33]，將利用Structure 2.2軟件計算的后驗概率作為協變量，將SSR標記與水稻耐鹽相關性狀進行回歸分析。在P<0.01時，認為SSR標記與耐鹽相關性狀的關聯性顯著，統計關聯位點對表型變異的貢獻率。

2 結果與分析

2.1 粳稻種質資源苗期耐鹽相關性狀間的相關性分析

由表2可以看出，耐鹽級別與相對苗高、相對地上部鮮質量、相對根鮮質量均呈極顯著正相關，與相對莖粗呈顯著正相關，與葉片傷害百分率、相對根冠比均呈極顯著負相關。其中，耐鹽級別與葉片傷害百分率的相關系數最大，為-0.657。葉片傷害百分率與相對苗高、相對莖粗、相對地上部鮮質量均呈極顯著負相關，與相對根冠比呈極顯著正相關。相對苗高與相對根長、相對莖粗、相對地上部鮮質量均呈極顯著正相關，與相對根鮮質量呈顯著正相關，與相對根冠比呈極顯著負相關。相對莖粗與相對地上部鮮質量呈極顯著正相關，與相對根冠比呈極顯著負相關。相對根長與相對根鮮質量呈顯著正相關。相對地上部鮮質量與相對根鮮質量呈極顯著正相關，與相對根冠比呈極顯著負相關。

表2 鹽脅迫下粳稻苗期耐鹽相關性狀之間的相關系數Tab.2 Correlation coefficient of traits related with salt tolerance of japonica rice germplasm resources at seedling stage under salt stress

注：**表示極顯著相關(P<0.01)，*表示顯著相關(P<0.05)。STS：耐鹽級別;LDP：葉片傷害百分率;RPH：相對苗高;RRL：相對根長;RSD：相對莖粗;RSFW：相對地上部鮮質量;RRFW：相對根鮮質量;RRS：相對根冠比。下同。

Notes:** and * mean significant correlations at 0.01,0.05 levels respectively.STS represents salt tolerant score,LDP represents leaf damage percentage,RPH represents relative plant height,RRL represents relative root length,RSD represents relative stem diameter,RSFW represents relative shoot fresh weight,RRFW represents relative root fresh weight,RRS represents relative ratio of root to shoot，the same below.

2.2 粳稻種質資源SSR標記遺傳多樣性分析

利用38對多態性好且均勻分布在水稻全基因組的SSR引物對160份粳稻種質資源進行遺傳多樣性分析發現，160份粳稻種質資源表現出較大的遺傳變異。共檢測到192個等位基因，其中，有效等位基因109.60個，有效等位基因所占比例為57.1%；各位點的等位基因數介于2～11個，平均每個位點檢測到5.05個等位基因，有效等位基因數介于1.09～6.88個，平均有效等位基因數為2.88個(表3)。SSR標記RM3513的多態性最好，其有效等位基因數為6.88個，Shannon’s信息指數、Nei’s遺傳多樣性指數分別為2.092 5、0.854 6；RM1136的多態性最差，其有效等位基因數僅為1.09個，Nei’s遺傳多樣性指數和Shannon’s信息指數均為最低。

表3 粳稻種質資源SSR標記遺傳多樣性

續表3 粳稻種質資源SSR標記遺傳多樣性

2.3 粳稻種質資源群體結構分析

由圖1可知，當粳稻種質資源亞群數為3時，△K值最高，參試的粳稻種質資源分布于穩定的類群中。后驗概率Q≥0.6的粳稻種質主要分為3個亞群(圖2)，深灰色區域為第一亞群，包括63份種質，大部分來源于我國的東北地區及云南、江蘇等省，來自歐洲的6份種質都屬于該類群；淺灰色區域為第二亞群，包括48份種質，主要來源于我國吉林、黑龍江、貴州、山西等省及日本、韓國、朝鮮等東亞國家；黑色區域為第三亞群，包括47份種質，除日本晴外，全部來源于寧夏回族自治區和新疆維吾爾自治區；剩余2份種質的后驗概率Q<0.60，被劃為混合類群，分別為鹽城268和黃葉彩稻。

圖1 ΔK值隨亞群數的變化Fig.1 Change of ΔK value with the subgroup number

圖2 160份粳稻種質資源的群體結構

對3個亞群粳稻種質的耐鹽級別、葉片傷害百分率、相對苗高等耐鹽相關性狀進行分析(圖3)發現，第三亞群粳稻種質的耐鹽級別顯著高于第二亞群，第一亞群種質的葉片傷害百分率顯著低于第二亞群，第三亞群的相對苗高顯著高于第一、二亞群，第二亞群的相對莖粗和相對根冠比顯著高于第三亞群，第一亞群的相對地上部鮮質量顯著高于第二亞群，相對根長和相對根鮮質量在3個亞群間均無顯著差異。總體來看，3個亞群中第三亞群耐鹽性相對較強，第二亞群耐鹽性較弱。

不同小寫字母表示不同亞群間的差異達到顯著水平(P<0.05)Different lowercase letters mean significant differences among different subgroups(P<0.05)圖3 不同亞群粳稻種質資源苗期耐鹽相關性狀表現

2.4 粳稻苗期耐鹽相關性狀與SSR標記的關聯分析

共檢測到與水稻苗期耐鹽相關性狀顯著關聯的SSR位點11個，分布于水稻第1、3、4、7、8、9、10、11、12染色體上，表型貢獻率為4.10%～18.85%(表4)。其中，位于第11染色體的相對地上部鮮質量關聯位點RM286-7的貢獻率最高，表型效應值為-8.83%，載體種質為TOPOLea；表型貢獻率最低的是位于第10染色體與相對苗高關聯的位點RM333-7，表型效應值為8.97%，載體種質為寧粳41號。在有利于提高水稻苗期耐鹽性的關聯位點中，位于第4染色體的耐鹽級別關聯位點RM7585-1的表型貢獻率較高，為6.80%，表型效應值為1.32，載體種質為Bertone。另外，同一位點的不同等位變異間表型效應存在一定的差異，如位點RM5647的2個等位變異中，1個為增效，1個為減效。

表4 與苗期耐鹽相關性狀顯著關聯的SSR位點及其表型貢獻率、表型效應值和載體種質

3 結論與討論

作物種質資源在漫長的自然進化和人工選擇過程中，積累了豐富的遺傳變異，其遺傳多樣性的高低是育種家在遺傳改良和新品種選育過程中選擇雜交親本的重要依據。在水稻種質資源遺傳多樣性評價中，多采用分子標記分析群體結構和遺傳多樣性指數[32-35]。本研究利用38個SSR標記對160份粳稻種質資源的遺傳多樣性進行分析發現，Shannon’s信息指數和Nei’s遺傳多樣性指數的平均值分別為1.139 4和0.586 9，與張曉麗等[34]的研究結果較為一致，遺傳多樣性低于張科等[35]的研究結果，這可能與種質資源的來源、群體的大小、分子標記的種類和數量密切相關。

關聯分析是剖析復雜數量性狀遺傳基礎、發掘目標性狀基因位點的重要方法。陳氏秋江等[33]利用SSR標記檢測了540份水稻品種的基因型，發掘了多個與水稻粒長、粒寬、粒厚和千粒質量等籽粒性狀緊密關聯的位點；在水稻耐鹽相關性狀的關聯分析研究中，李憲偉等[36]以176份粳稻種質資源為研究材料，利用中度蘇打鹽堿土進行芽期脅迫，共檢測到13個與粳稻芽期耐鹽堿性顯著關聯的SSR位點。本研究利用160份粳稻種質資源開展水稻苗期耐鹽相關性狀的SSR標記關聯分析，共檢測到與水稻苗期耐鹽相關性狀顯著關聯的SSR位點11個，分布于除水稻第2、5、6染色體外的其他染色體上，表型貢獻率介于4.10%～18.85%。其中，位于水稻第3染色體上的與相對地上部鮮質量關聯的位點RM5474與GHOMI等[37]檢測到的控制鹽脅迫下水稻地上部鮮/干質量和生物量的QTLsqSFW-3、qSDW-3、qBM-3位于相同的染色體區間；在水稻第4染色體上檢測到的與耐鹽級別相關聯的位點RM7585與ZHENG等[28]檢測到的控制水稻地上部鉀鈉比的關聯位點位于相近的染色體區間；在水稻第8染色體上檢測到的分別與耐鹽級別、相對地上部鮮質量、相對根冠比和葉片傷害百分率4個性狀相關聯的位點RM5647與控制地上部干質量的qDM-8[38]和調控地上部鉀鈉比的qSNK-8[37]位于相近的染色體區間；THOMSON等[39]在水稻第9染色體上RM24330附近分別檢測到控制地上部鈉鉀比、根鈉鉀比、耐鹽級別的qSNK9、qRNK9、qSES9，該位點在本研究中與相對根長相關聯。

分子標記聚合育種是作物遺傳改良的重要手段之一，通過多個有效基因的聚合，可有針對性地改良水稻的不良性狀，實現優良基因的整合。本研究檢測到多個水稻苗期耐鹽相關性狀的關聯位點，其中貢獻率較高的位點和等位變異可用于該關聯性狀的分子標記輔助選擇；用相應的載體種質為供體，與寧夏主栽水稻品種配制雜交組合，在F2直接選擇目標性狀位點為純合耐鹽等位變異的單株，在之后的世代可通過農藝性狀篩選，獲得綜合性狀良好、苗期耐鹽性強的優良品系，可為耐鹽水稻品種的選育提供優良的中間材料和技術支持。