60Co-γ輻照對丹香清脂顆粒中5種有效成分含量的影響

康江麗，吳 雯

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第900醫院，福建 福州 350000）

丹香清脂顆粒是由丹參、川芎、桃仁、降香、大黃等8味中藥材組方的中藥復方制劑，屬國家基本藥物，收載于2015年版《中國藥典（一部）》，有活血化瘀、行氣通絡功效，臨床主要用于治療高脂血癥屬氣滯血瘀證者[1]。丹參和川芎為方中君藥，有活血、化瘀、活絡功效，丹參主要成分有丹參酮ⅡA和丹酚酸B[2-3]，川芎主要成分為藁本內酯、洋川芎內酯A和洋川芎內酯I等[4-5]。該顆粒現行法定標準中僅有川芎、大黃和莪術的薄層色譜鑒別項及丹參酮ⅡA的含量測定項，用于其質量控制稍顯不足。

丹香清脂顆粒制作工藝復雜，為保證制劑成品質量，避免在加工和儲存過程中受到細菌污染，須采取滅菌措施。60Co-γ輻照滅菌法是以γ射線電離輻射產生的高能射線，通過物理和生物效應，破壞細菌中蛋白質的合成，從而達到殺菌效果，穿透力強、操作簡單、滅菌效果好，可在常溫下進行[6-7]。本研究中采用60Co-γ輻照丹香清脂顆粒進行滅菌，并建立高效液相色譜（HPLC）法同時測定丹香清脂顆粒中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、藁本內酯、洋川芎內酯A和洋川芎內酯I的含量，分別考察2，5，8 kGy 3個輻照劑量對上述成分含量的影響，確定最佳有效輻照強度，為丹香清脂顆粒生產工藝中的滅菌提供參考。現報道如下。

圖1 高效液相色譜圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵、G1329A自動進樣器、G1314B-DAD檢測器、G1316A柱溫箱、Agilent-Chemistation數據處理系統（美國Agilent公司）；AUW-220D型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；中藥粉碎機（浙江屹立工貿有限公司）；60Co-γ輻照裝置（深圳市金鵬源輻照技術有限公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LRH-150B型生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；ZOZ-AB型電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫療器械廠）；YJ-875型醫用凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）。

1.2 試藥

丹香清脂顆粒（吉林敖東集團大連藥業股份有限公司，批號分別為 170915，171209，180123，180217，180321，180511，180622，規格為每袋 10 g）；丹參酮ⅡA對照品（批號為110766-201721，含量 99.5%）、丹酚酸B對照品（批號為 111562-201716，含量 94.1%）、藁本內酯對照品（批號為111737-201608，含量 100.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內酯A對照品（批號為62006-39-7，含量97.2%），洋川芎內酯I對照品（批號為94596-29-5，含量97.5%），均購于上海純優生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-0.5% 磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時 42%A，10～25 min時 42%A→68%A，25～40 min時 68%A→88%A，40～50 min時 88%A→42%A）；流速:1.0 mL ／min；檢測波長:280 nm（0 ～39 min），268 nm（40 ～50 min）；柱溫:30 ℃[8-9]。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液:分別稱取各待測成分對照品適量，精密稱定，分別加80%甲醇制成每1 mL含丹參酮ⅡA1.2244 mg、丹酚酸 B 1.5125 mg、藁本內酯 0.6537 mg、洋川芎內酯A 0.5963 mg、洋川芎內酯I 0.4127 mg的混合對照品溶液，搖勻，低溫避光貯存。

供試品溶液:取裝量差異項下樣品，研勻，取約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照溶液:按丹香清脂顆粒處方和工藝制備缺丹參、川芎的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗:取上述混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。理論板數按各待測成分峰計均大于3000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

線性關系考察:精密量取混合對照品溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇定容，精密量取1，2，5，10，15，20，25 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍。詳見表1。

表1 回歸方程、線性范圍及定量限（n=7）

定量限考察:分別精密量取混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按擬訂色譜條件進樣測定，以信噪比（S／N）10∶1計算定量限。結果見表1。

精密度試驗:取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、藁本內酯、洋川芎內酯A和洋川芎內酯I峰面積的RSD分別為 1.21% ，1.03% ，1.12% ，0.82% ，0.89%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取供試品（批號為180321）溶液適量，分別于室溫下放置 0，3，6，9，12，18，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、藁本內酯、洋川芎內酯 A和洋川芎內酯 I峰面積的RSD分別為 1.13% ，0.90% ，1.02% ，0.83% ，0.71%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗:精密稱取樣品（批號為180321）6份，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、藁本內酯、洋川芎內酯 A和洋川芎內酯 I平均含量分別為1.1048，1.3622，0.2413，0.1927，0.1035 mg ／g，RSD分別為 1.31% ，1.01% ，1.10% ，0.84% ，0.91%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品（批號為180321）適量，共6份，分別加入低、中、高質量濃度的待測成分對照品溶液，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取7批樣品各適量，分別以2，5，8 kGy劑量60Co-γ輻照，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，平行3次，記錄峰面積并計算樣品含量。數據以SPSS 19.0統計學軟件分析，行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg／g，n=6）

3 討論

藁本內酯、洋川芎內酯A和洋川芎內酯I屬苯酞類成分，易受氧化、水解、光解、異構化等影響發生結構改變。藁本內酯的化學結構為不飽和的苯酞結構，3位上有活潑的丁烯基，均為化學不穩定性因素[10]；洋川芎內酯A含有的不飽和環易通過脫氫反應形成更加穩定的苯環結構[11]。

本試驗中取供試品溶液及各對照品溶液進行全波長掃描，結果顯示，丹參酮ⅡA、丹酚酸B在268 nm波長處有最大吸收，藁本內酯、川芎內酯A和川芎內酯I在280 nm波長處有最大吸收，故選擇2個波長進行測定。在流動相的選擇中，分別嘗試了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液4種不同體系。最后發現，以乙腈-0.5%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，各色譜峰之間分離良好，雜質峰無干擾。提取方法考察了回流提取、超聲提取，考慮到超聲提取簡單方便且提取完全，故選用超聲提取法，并通過比較不同提取溶劑體積及不同提取時間下超聲提取法對5種成分的提取率，最終確定為用80%甲醇作溶劑超聲提取45 min。本試驗中通過考察60Co-γ輻照對丹香清脂顆粒中5種有效成分含量的影響，發現輻照劑量控制在不超過5 kGy時，能對丹香清脂顆粒進行有效消毒滅菌，同時不影響制劑質量。該結論可為對該類藥物進行60Co-γ輻照滅菌提供參考。