血漿代謝物對腦出血發(fā)病的預測和診斷價值

段克非，由 楊，田步先

腦出血(Cerebral hemorrhage，CH)是一種病情進展快、致死致殘率高的臨床常見疾病[1]，它是各種原因?qū)е碌木植磕X組織占位性病變，釋放某些活性物質(zhì)，使周圍腦組織發(fā)生變性、壞死[2]。臨床數(shù)據(jù)顯示，高血壓性腦出血是主要的自發(fā)性腦出血，占自發(fā)性腦出血發(fā)生的80%左右[3]。多數(shù)生存者均遺留嚴重的神經(jīng)功能缺損癥狀。目前CT和MRI等影像學方法已廣泛應(yīng)用到腦出血的診斷，但因需搬運患者、操作復雜等弊端，發(fā)現(xiàn)一些對腦出血診斷和病情演變具有預測價值的血液生物學標記物具有重要意義。

代謝組學(metabolomics)是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學后，致力于研究整個生物體的動態(tài)代謝狀態(tài)、對低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析的一門學科[4]。該組學在分子層面上探討疾病導致的代謝物濃度變化，尋找與疾病相關(guān)的代謝標記物，為臨床治療提供有力幫助。該技術(shù)應(yīng)用于多種疾病的診斷與預后，如糖尿病腎病[5]、結(jié)核病[6]、腫瘤[7]等疾病，然而應(yīng)用基于代謝組學分析的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血漿代謝物指標與腦出血的研究相關(guān)性相對罕見。因此本研究通過分析腦出血患者與正常對照者的代謝譜，尋找腦出血發(fā)病后的差異代謝物，進一步認識腦出血的發(fā)病機制，為臨床治療提供新的方向。

在本文中，高血壓性腦出血占絕大多數(shù)，根據(jù)頭部CT掃描發(fā)現(xiàn)腦出血的部位主要分布在殼核、腦葉、丘腦等區(qū)域。其導致腦出血發(fā)病的機制仍不明確，可能與氨基酸、肉堿等代謝循環(huán)障礙，加重血壓的升高相關(guān)，從而誘發(fā)腦出血的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究主要納入2017年5月～2018年11月就診于錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院部的患者，分為研究組和對照組。研究組入選標準：(1)符合第4屆全國腦血管病學術(shù)會議[8]制定的診斷標準及頭部CT掃描確診為腦出血患者；(2)均為自發(fā)性首次腦出血；(3)發(fā)病至入院行CT掃描檢查的時間<24 h。研究組排除標準：(1)腦梗死、顱內(nèi)腫瘤等其他疾病導致的出血轉(zhuǎn)化、靜脈竇血栓等引發(fā)的出血；(2)因外傷等其他原因引起的腦出血；(3)嚴重肝腎疾病及惡性腫瘤；(4)無法配合本次研究實施的患者。對照組入選標準：(1)同期同年齡段健康體檢者；(2)無腦出血病史及其他嚴重疾病史。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學附屬一院倫理委員會審查和批準，所有受試者均為自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 專業(yè)的醫(yī)護人員根據(jù)統(tǒng)一方案對所有受試者進行指尖血樣采集和樣品制備。所有受試者于隔夜空腹8 h以上，入院后未進行用藥前采集首次指尖血，滴入串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX 4000)檢測專用濾紙片的3個孔板中，形成直徑大于8 mm且分布均勻的血斑，晾干后送檢。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜儀對所有樣本進行代謝組學分析(具體操作方法可參考相關(guān)文獻[9])，測得23種氨基酸、35種肉堿和35個對應(yīng)比值共93個代謝物指標。詳細詢問并記錄受試者的一般臨床資料(包括年齡、性別、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史及飲酒史)。

1.2.2 278例患者均應(yīng)用80排160層螺旋CT進行掃描，掃描參數(shù)設(shè)置為120 Kv，600 mA，矩陣512×512，層厚5 mm，層距5 mm。所有患者均在發(fā)病24 h之內(nèi)實施頭部CT掃描檢查，并對其出血部位、出血量進行觀察，同時采用容積測量法對患者的血腫大小進行計算。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析 本研究納入278例患者，其中研究組為138例，對照組為140例。患者的一般臨床資料見表1，研究組和對照組之間的年齡、高血壓病、糖尿病、吸煙史及飲酒史有顯著性差異(P<0.05)，性別無顯著性差異(P>0.05)。受試者頭部CT示出血部位、出血量見表2。

表1 受試者一般臨床資料

注：a應(yīng)用卡方檢驗；b應(yīng)用獨立樣本t檢驗

表2 受試者出血量及出血部位

2.2 OPLS-DA模型 OPLS-DA回歸分析是一種預測性建模技術(shù)，采用該分析方法篩選腦出血組與正常對照組間差異顯著性代謝物，得到相應(yīng)的散點分布圖(見圖1)。由圖可見研究組和對照組能明顯分開(R2Y=0.636、Q2Y=0.583)，說明其預測能力和解釋能力較強。Permutation實驗累計的R2和Q2(左下部)明顯低于原始的R2和Q2值(右下部)，可以證明OPLS-DA模型是穩(wěn)定的、有效的。[截距：R2(0.0，0.151)，Q2(0.0，-0.246)](見圖2)。

圖1 OPLS-DA散點圖(1：腦出血組：綠色；2：對照組：藍色)

圖2 Permutation實驗(1：腦出血組：綠色；2：對照組：藍色)

2.3 篩選組間差異性代謝物 對血漿中93個代謝物指標進行篩選。篩選出滿足VIP>1.0、AUC>0.7及P<0.01條件的指標，共23個(見圖3)。

2.4 篩選顯著差異代謝物 Logistic回歸分析是一種線性回歸分析模型，可以很好的說明敏感的代謝物在研究組和對照組的差異。將圖3中的23個代謝物納入Logistic回歸分析篩選顯著差異代謝物(P<0.05)，最終有8個指標納入模型，分別是Tyr、Orn/Cit、Phe/Try、Cit/Arg、C4/C8、C18：2、C26、C3DC。并得到回歸方程式Y(jié)=-1.332*C4/C8+6.519*Orn/Cit-18.297*Phe/Tyr+0.790*Cit/Arg-0.178*Tyr+5.411*C18：2+164.239*C26+81.491*C3DC+2.367。根據(jù)此方程式，我們計算一個新指標W。8個代謝物及新指標W在研究組和對照組的表達量見相關(guān)性矩陣(見圖4)和小提琴圖(見圖5)。

該圖可以看到各個代謝物之間的線性相關(guān)程度，紅色表示兩個變量呈正相關(guān)，而且色彩越深、圓形面積越大，表示變量相關(guān)性越大。

圖4 相關(guān)性矩陣圖

由左上至右下代謝物依次為W、Tyr、Phe/Tyr、Orn/Cit、Cit/Arg、C18：2、C26、C4/C8、C3DC。小提琴圖中每一個點代表個體統(tǒng)計量，各圖中間紅點所在縱坐標為樣本中位數(shù)。比較研究組與對照組中位數(shù)的大小，可以反應(yīng)血漿代謝物在兩組間差異。此圖可以清晰的看出與對照組相比，研究組Cit/Arg、Orn/Cit、Tyr、肉堿(C3DC、C26、C18：2)含量較低，而Phe/Tyr、肉堿(C4/C8)含量較高

圖5 小提琴圖

圖6 ROC曲線

2.5 檢驗模型預測的準確性 分析新指標W對腦出血的預測價值。用ROC曲線下面積(AUC)的大小評價診斷效果，AUC越接近于1，說明診斷效果越好。篩選出的8種代謝物曲線下面積值均大于0.7(見圖6)，說明異常代謝物對疾病的診斷性有一定的準確性。設(shè)定的新指標W為8種代謝物的綜合性指標，其AUC的大小為0.993，大于其他所有代謝物AUC，提示結(jié)合多種代謝物將會提高對疾病的診斷價值。

3 討 論

多年來，腦出血的發(fā)病率及病死率在全球范圍內(nèi)始終居高不下，尋找新的診治方案迫在眉睫。對于腦出血患者來說，其在發(fā)病之后腦內(nèi)微小動脈會出現(xiàn)不同程度的痙攣改變，將會導致患者在發(fā)病較短時間內(nèi)出現(xiàn)腦組織缺血缺氧，甚至腦組織壞死，如果不及時治療，則很可能會出現(xiàn)血腫范圍迅速擴大，加重病情，甚至有危及生命的風險[10]。因此，如果及早的發(fā)現(xiàn)高靈敏性和特異度的腦出血的代謝物指標，有可能為早期、快速、可靠診斷和預防提供有力幫助。

已有研究表明腦出血后興奮性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)水平上升，而抑制性氨基酸(甘氨酸、γ-氨基丁酸)水平下降[11]。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦出血組：Cit/Arg、Orn/Cit、Tyr，C3DC、C26、C18：2含量較低，而Phe/Tyr、C4/C8含量較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

鳥氨酸循環(huán)是將機體各種代謝途徑中產(chǎn)生的氨轉(zhuǎn)換成尿素，經(jīng)尿液排出體外。在鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶、精氨酸代琥珀酸合成酶和精氨酸代琥珀酸裂解酶等關(guān)鍵酶的作用下，鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸相互轉(zhuǎn)化。同樣，研究發(fā)現(xiàn)[12]在精氨酸、瓜氨酸、一氧化氮之間也存在一種循環(huán)稱作瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)。一氧化氮屬于一類重要的內(nèi)皮功能舒張調(diào)節(jié)因子，在血壓控制中起關(guān)鍵作用，其與高血壓的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[13]。本文研究結(jié)果顯示，腦出血患者Cit/Arg、Orn/Cit降低，其機制可能與上述兩個循環(huán)代謝障礙相關(guān)，從而導致血壓改變，同時一氧化氮代謝障礙可產(chǎn)生過多的氧自由基，加重血管內(nèi)皮細胞損傷[14]，加重出血的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)不對稱二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶的內(nèi)源競性抑制劑可加快血管收縮，因此血壓明顯升高[15]，容易誘發(fā)腦出血。

苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，屬芳香族氨基酸。苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化成酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化成多巴胺能，生成去甲腎上腺素和腎上腺素。研究發(fā)現(xiàn)[16]，血液中苯丙氨酸水平增高，腦電圖異常率明顯增高，同時對腦血管產(chǎn)生中重度損傷，進而造成腦出血的發(fā)生。Kofler等[17]研究表明在患有蛛網(wǎng)膜下腔出血的背景下，測量的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的腦間質(zhì)水平顯著降低，且往往伴有情緒改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血患者中Phe/Tyr升高，Tyr降低，其可能與苯丙氨酸代謝途徑中的某種關(guān)鍵酶缺乏或關(guān)鍵代謝通路障礙有關(guān)，其機制仍不明確，需要擴大樣本繼續(xù)探查。此外，Hufner[18]和Felger[19]研究發(fā)現(xiàn)，在多巴胺能/去甲腎上腺素能途徑中，患抑郁癥的腫瘤患者中血液中Phe/Tyr往往升高。

人體內(nèi)的肉堿根據(jù)碳原子數(shù)量可分為長鏈和短鏈酰基肉堿。肉堿有重要的生理作用包括：(1)肉堿存在于肌細胞中的線粒體中，β氧化供能；(2)抗氧化作用；(3)肉堿也與參與免疫系統(tǒng)的功能有關(guān)，參與支鏈氨基酸代謝[20]。本文研究中，與對照組比較，腦出血組C3DC、C18：2、C26降低，而C4/C8升高。其原因可能是脂肪酸β氧化功能失調(diào)，出現(xiàn)微循環(huán)障礙[21]，進而誘發(fā)腦出血。Catharina等[22]研究發(fā)現(xiàn)隨著血清左旋肉堿水平的增加，動態(tài)收縮壓和舒張壓顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)BP與游離左旋肉堿和長鏈酰基肉堿之間存在獨立的正相關(guān)性，血壓過高有可能誘發(fā)腦出血的發(fā)生。Soyer 等[23]發(fā)現(xiàn)左旋肉堿減少氧化應(yīng)激所致血管損傷，對腦出血后腦血管痙攣的消退有潛在益處。此外研究發(fā)現(xiàn)，短鏈酰基肉堿與芳香族氨基酸代謝有關(guān)[24]。

綜上所述，Phe/Tyr、Tyr、Cit/Arg、Orn/Cit、C4/C8、C3DC、C18：2、C26等血漿代謝物指標與腦出血的發(fā)病相關(guān)。然而，我們需進一步明確這些物質(zhì)在腦出血發(fā)生發(fā)展中的機制，為臨床治療提供新的前景。