9型腺相關病毒攜帶IL4對阿爾茲海默病模型大鼠學習記憶能力的影響

張淑萍，許鵬嬌，辛 華，姜曉雪，劉文娟

阿爾茲海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一組中老年起病的常見的慢性進行性神經系統退行性疾病，伴有認知記憶能力損傷、智力減退和行為人格退化。研究發現AD 患者神經元細胞外淀粉樣蛋白(amyloid β- protein，Aβ)沉積，晚期可激活巨噬細胞引發炎性反應。巨噬細胞在中樞神經系統分為兩型，M1型巨噬細胞激活后可加重炎癥反應，使 Aβ沉積進一步加重而促進AD進展，形成惡性循環。M2型巨噬細胞可通過分泌抗炎因子抑制炎癥進展[1]。基于目前國內外研究已知IL-4是激活巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化的主要因子[2]。

基因治療已經成為許多疾病治療的研究方向，其優點在于只需一次注射便可持續表達目的基因，且安全、轉染效率高。隨著生物技術的發展，重組腺相關病毒rAAV已經成為外源基因干預治療研究領域的熱點工具載體。在眾多用于基因治療的病毒載體中，目前唯一沒有引起人類宿主任何病理反應的是rAAV載體[3，4]，且其宿主范圍廣、表達穩定，被認為是目前較理想的轉運載體。有研究證實在神經系統中AAV9 表達較腺相關病毒其他分型高，且靜脈給藥時AAV9 血腦屏障通過率較高。基于上述觀點，本實驗利用過表達IL4的9型腺相關病毒，促使巨噬細胞向M2型極化，研究其對中樞神經系統的影響。

為了評估AAV9-IL4對于 AD的防治作用，行為學測試不可或缺。本實驗利用Aβ1-42蛋白沉積制作的老年癡呆模型，在此模型的基礎上將過表達IL4的9型腺相關病毒尾靜脈注射到大鼠體內，用水迷宮檢測模型大鼠的學習記憶能力，從而為針對AD患者臨床治療提供新的線索，為針對AD的免疫治療提供新的理論依據[5]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境 SPF 級 SD 大鼠75只，雄性，3月齡，體重(300 ±20)g，利用海馬區注射Aβ1-42制作老年癡呆模型，實驗中應用的所有動物及其飼養按照中國動物保護法相關條例進行，倫理學方面符合黑龍江省實驗動物管理委員會要求。

1.2 實驗動物分組和處理 利用海馬區注射Aβ1-42制作老年癡呆模型的雄性SD大鼠75只，隨機分為實驗組和對照組，實驗組39只大鼠，尾靜脈注射AAV9-IL4，對照組36只，尾靜脈注射等同劑量的AAV9空載。

1.3 大鼠進行尾靜脈注射AAV9-IL4 對已構建好的AD模型大鼠AD手術后1 d就開始進行尾靜脈注射包裝并測定好滴度的腺相關病毒(滴度5*10^13 v。g/ml)AAV9-IL4與AAV9空載對照。實驗組的大鼠經尾靜脈注射5 μl AAV9-IL4，對照組大鼠注射同等劑量的AAV9空載，持續14 d。

1.4 水迷宮檢測模型大鼠的學習記憶能力 我們分別采用經典的Morris水迷宮進行定位航行實驗和空間探索試驗來檢測手術2 w，4 w，8 w后大鼠的學習記憶能力。水迷宮直徑設置為150 cm，高60 cm，第一象限內放置一平臺，平臺直徑12 cm。池水深30 cm(高出平臺2 cm)，設置成不透明黑色。大鼠是否能夠在水迷宮測試中順利找到平臺，除了受空間、學習記憶能力影響外，還受到大鼠本身視覺以及游泳速度等條件的影響[6]。本實驗的根本目的是檢驗實驗大鼠的學習以及記憶能力，所以，參照學習實驗設置在水迷宮定位航行實驗前，以除外游泳速度以及視覺等因素對大鼠的干擾。

(1)參照學習實驗：將大鼠面向池壁在第一象限中央位置放入水中，讓其尋找平臺。如果60 s內成功找到，大鼠平臺上休息10 s；若 60 s內未能找到，則引導至平臺上，同樣休息 10 s。此目的是確保所有實驗大鼠有相等的時間來觀察和獲取空間信息，除外視覺因素對大鼠的干擾。

(2)定位航行實驗：每次隨機從4個區域中的其中一個將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠逃避潛伏期(逃避潛伏期：大鼠在池內游泳至找到水面下的平臺的時間)。找到平臺后，允許大鼠在上停留30 s。若超過60 s后仍然沒有找到平臺，引導大鼠，潛伏期則記為60 s。定位巡航試驗持續5 d，2次/d。

(3)空間探索實驗：在定位航行實驗后1 d，將水下平臺移除。為檢測大鼠記憶能力，隨機選擇一個位置將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠在第1象限內游泳時間占總游泳時間的百分比以及60 s內的穿越原平臺象限的次數。

2 結 果

2.1 兩組大鼠2 w時間點逃逸潛伏期 通過與對照組比較，實驗組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=140.21，P<0.001)。比較1～5 d實驗組大鼠逃逸潛伏期，大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=148.49，P<0.001)，可證明實驗組大鼠有學習記憶能力(見表1)。

2.2 兩組大鼠4 w時間點逃逸潛伏期 實驗組與對照組比較，大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=1018.57，P<0.001)。1～5 d實驗組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=41.69P<0.001)(見表2)。

2.3 兩組大鼠8 w時間點逃逸潛伏期 實驗組與對照組比較，大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=634.40，P<0.001)。1～5 d實驗組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(F=34.72，P<0.001)(見表3)。

2.4 兩組大鼠穿越隱藏平臺的次數及在目標限游泳時間占總游泳時間的百分比 通過與對照組比較，實驗組大鼠穿越平臺次數明顯增多(F=109.23，P<0.001)，且實驗組2 w與4 w大鼠穿越平臺次數有差別，4 w與8 w相比較差別不明顯。在目標限游泳時間占總游泳時間的百分比明顯延長(F=675.56P<0.001)，且實驗組2 w與4 w在目標限游泳時間占總游泳時間的百分比差別不明顯，4 w與8 w相比有差別(見表4)。

表1 2 w時間點逃逸潛伏期比較

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

表2 4 w時間點逃逸潛伏期比較

Comparison between control group and experimental group*P<0.01

表3 8 w時間點逃逸潛伏期比較

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

表4 目標限游泳時間占總游泳時間的百分比

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

通過 Two-Way ANOVA統計分析比較各組間逃逸潛伏期，我們發現 IL4-AAV9組SD大鼠逃逸潛伏期明顯低于 AAV9組SD大鼠。定位航行實驗過程中，我們發現：隨著訓練次數的增加，各組大鼠池內游泳至找到水面下的平臺的時間明顯縮短，證明大鼠有學習記憶能力。我們比較了各組大鼠在 60 s內穿越原平臺象限的次數及其在第一象限內游泳時間占總游泳時間的百分比。空間探索實驗結果顯示：IL4-AAV9 組單位時間平均穿越平臺次數顯著高于AAV9組，且2 w、4 w差異顯著，4 w、8 w無明顯差異。IL4-AAV9 組單位時間目標象限游泳時間占總時間比顯著高于AAV9組，且2 w、4 w無明顯差異，4 w、8 w差異顯著。

3 討 論

AD是一種以記憶損害為主，認知功能改變為特征的中樞神經系統退行性疾病。目前普遍認為AD發病機制中的中心環節為Aβ1-42蛋白的沉積，Aβ1-42蛋白的生成與清除失衡是細胞內神經元纖維纏結最終導致老年癡呆發生的主要原因[7，8]。記憶損害是 AD 患者最早期、最典型的臨床表現，也是判定AD患者嚴重程度的重要指標。為了檢測記憶能力，行為學檢測是 AD 動物實驗研究中必不可少的，行為學檢測方法多種多樣，檢測的目標也各有不同[9]。Morris 水迷宮作為行為學檢測的一種方法，可以從學習記憶和空間探索兩方面來檢測大鼠的認知水平。動物的學習和記憶能力也會受到環境、心理和自身等多方面的影響[10]，實驗過程中保持室內燈光、濕度和溫度不變，排除實驗環境的干擾；實驗過程中飼養員和實驗員固定，排除大鼠心理因素的干擾。

腺相關病毒血清學種類較多，其中AAV9 在 CNS 疾病中的療效已得到肯定[11～13]。AAV9在不同的注射方式下可展現出不同的轉導特性，其轉導效率因病毒包裝加工、疾病模型和實驗方法的不同存在差異。研究表明，肌注腺相關病毒會引發與注射劑量相關的 T 細胞免疫反應[14]，尾靜脈給藥相比之下較為傳統、簡單、微創且具有單次注射即可實現 CNS 普遍轉導的特點。另外，不同滴度不同注射劑量注射對大鼠學習記憶改善的影響也不盡相同。已知IL-4是激活巨噬細胞向M2型極化的主要因子，本研究利用了海馬區注射Aβ1-42制作的老年癡呆模型，在此模型的基礎上將過表達IL4的9型腺相關病毒尾靜脈注射到大鼠體內，用水迷宮檢測模型大鼠的學習記憶能力，結果顯示，尾靜脈轉染AAV9-IL4后，AD大鼠的學習記憶能力和探索能力均得到了明顯改善。上述實驗結果表明IL4-AAV9能夠顯著改善SD大鼠的空間學習記憶能力。

因此，應進一步研究AAV9轉導IL4使巨噬細胞極化在AD模型中如何發揮作用的可能機制。