高分子微針導入聯合卡泊三醇軟膏治療小鼠銀屑病的實驗研究

梁 玲 ，陳博智 ，沈長兵 ，崔 勇 ?，郭新東 ?

（1.北京化工大學 材料科學與工程學院，北京 100029；2.中日友好醫院 皮膚病與性病科，北京 100029；3.中國醫學科學院北京協和醫院 研究生院，北京 100730）

銀屑病是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病。咪喹莫特是一種小分子免疫調節劑，可以誘導誘導用藥部位產生炎癥因子，出現類似銀屑病的癥狀[1]。高分子微針預處理皮膚，可以形成微孔道，增加了藥物的經皮滲透率，對銀屑病的治療起到很好地促進作用。但是缺少實驗依據，無臨床上的應用。本實驗小鼠造模成功后用高分子微針處理，觀察聯合卡泊三醇對銀屑病的治療效果，為高分子微針導入藥物治療皮膚病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物為4～6周雌性Balb/c小鼠30只，體重16g左右，由維通利華提供，合格證號為京ICP備15004894號-1。在SPF級動物房內用標準飼料和小鼠專用水飼養，攝食飲水自由。

實驗藥品：5%咪喹莫特乳膏（3g：0.15g，四川明欣藥業有限公司產，批號18060340），卡泊三醇軟膏（15g：0.75mg，愛爾蘭利奧制藥有限公司產，批號 A70529），聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184，美國道康寧公司，批號 H04714G076），聚乳酸（PLA，Lakeshore生物材料有限公司）。

儀器：超聲波清洗器（北京博翔興旺科技有限公司，型號：BXXW-30AL）、激光刻蝕機（美國U-niversal，型號：VLS 3.5，50W）、小動物專用吸入麻醉機（美國Matrx集團，型號：VMR），數字波片儀（德國萊卡，型號：DM6 B）。

1.2 方法

1.2.1 高分子微針的制備

首先，制備聚二甲基硅氧烷（PDMS）板。將PDMS的預聚物和固化劑按質量比10：1混合，充分攪拌。在真空干燥箱內放置去除其中的氣泡。將未固化PDMS倒入夾板中，在恒溫恒濕箱60℃固化5h，得到PDMS板。然后，在PDMS板上平鋪厚度為0.3mm的硅膠板，通過控制激光雕刻機激光的能量和速度打出所需高度的PMDS模板[2，3]。此實驗中高分子微針規格為高度300μm，間距1000μm，底部直徑 150μm（圖1）。

1.2.2 動物分組

圖1 高分子微針的光學顯微圖

將Balb/c小鼠適應性飼養2周，在30只小鼠內任取10只，作為組1（空白對照組），剩下的20只隨機分為4組，分別為組2（造模組）5只、組3（咪喹莫特組）5只、組4（卡泊三醇治療組）5只及組5（高分子微針處理組）5只。

1.2.3 造模方法

5%濃度的咪喹莫特乳膏均勻涂抹于小鼠兩耳內外側，給藥量為 20mg/cm2，1次/d，連續涂抹6d，建立銀屑病模型。

1.2.4 給藥及處理方法

空白對照組不給予任何處理，其余組造模。造模d7，空白對照組隨機處死5只，造模組全部處死，取耳部用組織固定液固定，做組織病理學研究。造模成功后，咪喹莫特組不做任何處理；卡泊三醇治療組在兩耳內外側均勻涂抹卡泊三醇軟膏，1次/d，每次30mg/cm2；高分子微針處理組先用高分子微針預處理，打開一條微孔道，再用卡泊三醇軟膏治療，治療方法同卡泊三醇治療組。治療5d后，空白對照組剩余的5只小鼠與咪喹莫特組、卡泊三醇治療組、高分子微針處理組小鼠一起處死，取耳部做組織病理學研究。

1.3 觀察指標

肉眼觀察小鼠耳部鱗屑、紅斑、浸潤、皮損情況，以評價造模效果及治療療效。光鏡下觀察耳部皮損病理變化，利用軟件對圖像進行分析，參照Baker法進行組織學評分[4]，并對炎癥細胞浸潤計數[5]。

1.4 統計學方法

應用SPSS22.0軟件進行統計學處理，所有數據用均值±標準差表示，采用t檢驗和單因素方差檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 肉眼觀察耳部形態結果

咪喹莫特處理的d2，小鼠耳部由白色變成粉紅色，d4出現細小的白色鱗屑，血管擴張明顯，嚴重部位有紅斑出現。d7，角質層增厚明顯，出現大片鱗屑，血管擴張明顯。停用咪喹莫特乳膏后，有明顯的好轉，且用高分子微針處理優于只用卡泊三醇治療（圖2見封二）。

圖2 各組小鼠雙耳的形態比較

圖3 小鼠耳部皮膚病理改變（HE×100）

2.2 光鏡下觀察結果

空白對照組光鏡下觀察可見皮膚結構完整，表皮層未見角化過度及角化不全、棘層增厚、顆粒層變薄或消失的情況，角質層很薄，真皮層未見毛細血管擴張或水腫，只有稀疏散在的炎癥細胞浸潤。造模組表皮層廣泛存在角化過度、顆粒層變薄、棘層明顯增厚，其中多處可見Munro微囊腫，真皮層毛細血管擴張、充血、水腫，血管周圍有輕到中度的炎癥細胞浸潤。

表1 Balb/c小鼠耳部銀屑病組織學評分及炎癥細胞浸潤評分

表1示，空白對照組和造模組的組織學評分和炎癥細胞浸潤評分，均存在顯著性差異（均P＜0.01），表明造模成功。停用咪喹莫特乳膏，組3、組4、組5小鼠耳部皮膚有所改善，皮膚結構完整，表皮層的角化過度程度減輕，顆粒層變薄程度減輕，棘層增厚程度減輕，真皮層毛細血管擴張程度減輕。組5減輕程度較組3、組4高，表明高分子微針預處理對銀屑病的治療有效（圖3見封二）。組4（卡泊三醇治療組）與組5（高分子微針治療組）比較，組5皮損減輕程度顯著大于組4（P＜0.01），表明高分子微針預處理能促進藥物吸收利用，更好地改善銀屑病癥狀。

3 討論

銀屑病是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，其主要特征是角化過度或角化不全，角質層內出現中性粒細胞構成的Munro微囊腫，顆粒層變薄或消失，棘層增厚，血管扭曲擴張，管壁輕度增厚，真皮上部輕到中度炎細胞浸潤[6，7]。銀屑病病因復雜，目前主要認為與環境、遺傳、感染、內分泌、免疫等因素有關，是多基因遺傳背景下T細胞異常的炎癥性疾病[8]。造模7d時，可看到小鼠耳部有大量鱗屑出現，局部有紅斑，毛細血管擴張，符合銀屑病的相關癥狀。

銀屑病幾乎不在動物身上出現，所以很難找到理想的動物模型[9]。咪喹莫特是一個小分子的免疫調節劑，能誘導用藥局部產生多種炎癥因子，出現類似銀屑病的癥狀。本實驗中用咪喹莫特造模[1]，刺激小鼠耳部出現銀屑病癥狀。研究結果顯示，造模組組織學評分與炎癥細胞浸潤評分與空白對照組對比均明顯升高（P＜0.01），表明小鼠銀屑病模型造模成功。

20世紀90年代以來，隨著微機電加工技術的發展及經皮給藥系統的逐漸完善，一種新的給藥途徑——微針經皮給藥的出現，使得傳統注射針法和膏藥治療的缺陷被彌補[10]。目前，應用于皮膚表面預處理增強藥物滲透率的微針根據材質不同分為硅微針、金屬微針和高分子微針。Park等人[11]采用生物可降解的高分子通過基于模具的制造方法來制備高分子實心微針。與硅微針和金屬微針相比，高分子微針具有很多優勢。首先，由于高分子聚合物具有粘彈性的性質，改善了高分子實心微針耐剪切誘導斷裂的機械優點。其次，高分子實心微針通常在可以重復使用的模具中制備，因此高分子實心微針具有造價低，易于批量化制備的優點。此外，高分子微針有很好的生物相容性和可降解性，對皮膚傷害極小。最重要的是，微針在進行給藥時，通過刺穿皮膚的最外層即角質層為藥物的遞送打開了一條由角質層到表皮層或真皮淺層的微通道，使得藥物活性分子到達表皮層或真皮淺層時，能夠更好地被吸收，從而增加藥物經皮滲透率。本研究通過卡泊三醇治療組、高分子微針處理組與咪喹莫特組對比，其評分明顯降低（P＜0.01），表明卡泊三醇對咪喹莫特誘導的銀屑病有很好的治療作用，能夠抑制銀屑病皮損的增生和分化。高分子微針處理組評分明顯低于卡泊三醇治療組（P＜0.01），說明微針的預處理能夠打開一條微孔道，使藥物更容易進入皮膚，增加了藥物的吸收利用率，增加銀屑病的治療療效。

本研究證實，咪喹莫特造模操作簡單，組織病理學上符合銀屑病病理特征，是研究銀屑病的一種理想模型。高分子微針預處理，能很好地改善銀屑病模型的病理變化，為微針的臨床應用提供了依據，將來有望應用于臨床，解決銀屑病患者給藥吸收率低、效果差的問題。