自身免疫性肝病重疊綜合征患者外周血中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平研究

張小丹，陳 杰，韓 瑩，黃云麗，黃春洋，劉燕敏，廖惠鈺，單 晶

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病免疫科，北京 100069）

自身免疫性肝病包括自身免疫性肝炎（au- toimmune hepatitis，AIH）、原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliray cholangitis，PBC）、 原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）和重疊綜合征。部分患者可同時(shí)或在病程的不同階段存在2種自身免疫性肝病的臨床、血清學(xué)、組織學(xué)特征，稱(chēng)為自身免疫性肝病重疊綜合征，以AIHPBC重疊綜合征（autoimmune hepatitis-primary biliary cholangitis overlap syndrome，AIH-PBC OS）最為多見(jiàn)，約占AIH患者的10%[1，2]。迄今為止，包括重疊綜合征在內(nèi)的自身免疫性肝病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，有研究報(bào)道調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在AIH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[3]。因此我們回顧觀察了近年來(lái)收治的23例AIH-PBC重疊綜合征患者調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分布特點(diǎn)，與同期的AIH患者和健康人群進(jìn)行對(duì)比，探討調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群特征與AIH-PBC重疊綜合征發(fā)病的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2013年1月～2018年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病免疫科的就診患者。AIH組納入患者94例，男11例、女83例；年齡 21～82 歲，平均（52.2±12.3）歲。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）AIH診斷符合1999年國(guó)際自身免疫性肝炎小組（IAIHG）修正的AIH診斷計(jì)分系統(tǒng)：治療前IAIHG 評(píng)分≥10 分[4]；（2）I型 AIH：抗核抗體（antinuclear antibodies，ANA）和（或）抗平滑肌抗體（anti-smooth muscle antibody，SMA）陽(yáng)性；（3）未經(jīng)糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療。

納入重疊綜合征（OS）組AIH-PBC OS患者23例，男3例、女20例；年齡33～78歲，平均（53.2±11.1）歲。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）參照 1998 年 Chazouillems等提出的AIH-PBC重疊綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)（巴黎標(biāo)準(zhǔn)），即AIH和PBC 3項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的各2項(xiàng)同時(shí)或者相繼出現(xiàn)[5]。AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：①血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）＞5U/L。②血清免疫球蛋白G（IgG）≥2U/L或血清SMA陽(yáng)性。③肝臟組織學(xué)提示中重度界面性肝炎。PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：①血清ALP≥2U/L或血清GGT≥5U/L；②血清抗線粒體抗體（antimitochondrial antibodies，AMA）陽(yáng)性；③肝臟組織學(xué)表現(xiàn)為非化膿性破壞性膽管炎。（2）未經(jīng)糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療。

健康對(duì)照組：健康體檢者20人，其中男2例、女18例；年齡50.8±9.5歲。3組患者年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05）。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）合并 Wilson病、遺傳性疾病、藥物性肝炎、中毒性肝病、酒精性肝病和甲、乙、丙、丁、戊肝炎病毒感染或其他嗜肝病毒感染等；（2）年齡＜16歲；（3）合并惡性腫瘤；（4）IgG4 相關(guān)性疾病。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

使用日本Olympus AU 5400全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)ALT、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）和白蛋白（ALB）（上海科華生物制品有限公司）；采用ELISA法檢測(cè)自身抗體（購(gòu)自德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司）。凝血功能檢測(cè)采用日本Sys-mex CA-7000全自動(dòng)血凝儀；血清總IgG采用美國(guó)Beckman coulter Array 360全自動(dòng)特種蛋白分析儀檢測(cè)。

1.4 調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞檢測(cè)

使用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BDFACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)，試劑主要包括CD4-FITC試劑盒、CD25-PC5試劑盒（美國(guó)貝克曼公司）、anti-FOXP3抗體（美國(guó)invitrogen公司）等。取全血50μl按要求上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用BDFACSDiva software軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。檢測(cè)項(xiàng)目包括輔助性T細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值、CD4+CD25+T/輔助性T細(xì)胞比值、CD4+CD25-T細(xì)胞/輔助性 T細(xì)胞比值和Treg細(xì)胞（CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞）/輔助性T細(xì)胞比值。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞檢測(cè)和肝功能及免疫球蛋白檢測(cè)于同一天抽血完成。患者上述檢查均完成于保肝對(duì)癥治療期間，部分?jǐn)M予免疫抑制劑治療患者在開(kāi)始免疫抑制劑治療前完成。

1.5 肝穿病理檢測(cè)

37例AIH、5例AIH-PBC OS患者外院完成肝穿病理檢查并確診。57例AIH、18例AIHPBC OS患者入院后完成肝穿病理檢查后確診。我院肝穿病理檢查采用B超引導(dǎo)下MAGNUM活檢系統(tǒng)（Bard Peripheral Vascular，Inc，美國(guó)）經(jīng)皮穿刺取肝組織，穿刺肝組織長(zhǎng)度＞1.0cm；標(biāo)本采用10%甲醛溶液及時(shí)固定，石蠟包埋。連續(xù)切片后行HE、Masson三色、Gomori網(wǎng)織纖維和 D-PAS染色。由2名病理醫(yī)生獨(dú)立完成閱片[6]。

1.6 治療方法

入院后所有患者均予甘草類(lèi)制劑、水飛薊素、雙環(huán)醇等保肝對(duì)癥治療；合并膽汁淤積癥的AIH和重疊.綜合征組患者予熊去氧膽酸治療。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 2組患者一般資料、生化及免疫指標(biāo)比較

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料呈正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t或單因素方差分析檢驗(yàn)；呈偏態(tài)分布者以中位數(shù)表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。3組的差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料、生化及免疫指標(biāo)比較

表1示，2組患者 ALT、AST、TBIL、ALB、INR、ANA陽(yáng)性率及ASMA陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OS組患者GGT、ALP、IgG水平均顯著高于AIH 組（均 P＜0.05）。

表2 各組的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞特征

2.2 各組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞特征

3組檢測(cè)對(duì)象組間比較，輔助性T細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值、CD4+CD25+T/輔助性T細(xì)胞比值、CD4+CD25-T細(xì)胞/輔助性T細(xì)胞比值無(wú)顯著性差異（均 P＞0.05）。 而 Treg細(xì)胞（CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞）/輔助性T細(xì)胞比值存在顯著性差異（P=0.004，見(jiàn)表2）。 兩兩比較提示：CD4+CD25+T/輔助性T細(xì)胞比值，健康對(duì)照組顯著高于AIH組（P=0.001），也高于 OS 組（P=0.008）；AIH 組和 OS 組之間無(wú)顯著性差異（P=0.994）

3 討論

AIH-PBC重疊綜合征是重疊綜合征中最常見(jiàn)類(lèi)型，但其發(fā)病機(jī)制的研究少有報(bào)道[2，7]。CD4+輔助性T細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞在穩(wěn)定機(jī)體的免疫平衡、維持機(jī)體免疫耐受等免疫機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，其中CD4+CD25+FOXP3+的Tregs細(xì)胞主要用于維持自身免疫穩(wěn)定，識(shí)別自身抗原并抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，參與機(jī)體的免疫自穩(wěn)[8]。近年來(lái)相關(guān)研究證實(shí)Tregs細(xì)胞在1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了相當(dāng)關(guān)鍵的作用[9]。在自身免疫性肝炎方面，Longhi等[10]報(bào)道自身免疫性肝炎患者體內(nèi)Tregs細(xì)胞數(shù)目下降，F(xiàn)OXP3表達(dá)減少，而CD8+T細(xì)胞自發(fā)性凋亡較少，活性增強(qiáng)，提示Tregs細(xì)胞比例減少導(dǎo)致患者自身免疫過(guò)度，進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫損害形成自身免疫性肝炎。在本研究中AIH組患者Treg細(xì)胞/輔助性T細(xì)胞比值均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與 Longhi MS 等研究結(jié)果類(lèi)似[10，11]。同時(shí)OS組患者Treg細(xì)胞/輔助性T細(xì)胞比值也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；與 AIH組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。提示AIH-PBC重疊綜合征患者可能與AIH患者類(lèi)似免疫損傷機(jī)制，即Tregs細(xì)胞比例減少導(dǎo)致肝臟自身免疫過(guò)度反應(yīng)，進(jìn)而引起肝臟免疫炎癥。

本研究入選的2組病例中檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的同時(shí)也進(jìn)行了肝功能、凝血功能、自身抗體及免疫球蛋白檢測(cè)。AIH-PBC重疊綜合征患者采用巴黎標(biāo)準(zhǔn)診斷，納入病例的IgG和ALP、GGT水平均較高，雖經(jīng)過(guò)保肝對(duì)癥及熊去氧膽酸治療，患者膽汁淤積等指標(biāo)得到一定程度改善，但仍高于AIH組（P＜0.05）。相關(guān)研究認(rèn)為自身免疫性肝病患者T細(xì)胞亞群和Tregs細(xì)胞水平與ALT存在負(fù)相關(guān)[12]，但其他急性肝損傷，如藥物性肝損傷等也可以導(dǎo)致Tregs細(xì)胞比值一過(guò)性降低[6]。為保證各組患者免疫球蛋白、肝功能指標(biāo)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)的可比性，這些檢查均選擇同日檢測(cè)完成，本組患者在入院后均予保肝對(duì)癥治療，肝臟急性炎癥得到一定程度的控制，轉(zhuǎn)氨酶水平有所改善，我們比較了2組患者 ALT、AST、TBIL、ALB、INR 指標(biāo)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們認(rèn)為本研究是在肝功能受損程度類(lèi)似的前提下2組患者因免疫功能異常所致Tregs細(xì)胞水平變化的真實(shí)反映，而不是受其他致ALT水平升高的肝損害原因引起的Tregs細(xì)胞水平的一過(guò)性改變。

與AIH比較，AIH-PBC重疊綜合征的免疫機(jī)制研究更為缺乏。基于AIH-PBC重疊綜合征的臨床和病理特征，既往我們推測(cè)其與AIH可能存在某些相似的免疫發(fā)病機(jī)制。本研究的結(jié)果證實(shí)AIH和AIH-PBC重疊綜合征均有Tregs細(xì)胞比例下降的特點(diǎn)，可為下一步AIH-PBC重疊綜合征的發(fā)病機(jī)制的研究和治療策略的改進(jìn)提供線索。但AIH-PBC重疊綜合征發(fā)病率低，病例入選難度較大，因此該研究樣本量小，AIH-PBC重疊綜合征確切的免疫發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。