基于Oncomine數據庫分析ENO2在腎透明細胞癌中的表達和臨床意義

周立斌，龍慧民

(寧波市醫療中心李惠利醫院泌尿外科，浙江寧波 315040)

腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常見的腎臟惡性腫瘤，透明細胞腎癌 (clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)占所有RCC的80%。隨著手術水平的不斷進步及對腎癌的分子生物學和基因組學的深入研究，腎癌患者生存時間顯著延長，患者生活質量明顯提高[1]。然而，90%腎癌導致的死亡與轉移密切相關。雖然有不同的腎癌診斷和預后模型，但由于缺乏特異性和敏感性，其臨床使用價值非常有限[2]。因此，深入研究ccRCC發生發展的分子機制將有利于發現診斷和預后的標志物及開發新的分子靶向藥物。

癌癥相關數據的挖掘已在泌尿腫瘤中廣泛應用，為深入研究腎癌的發病機制提供了重要的線索[3-4]。本研究將充分利用Oncomine數據庫資源，分析烯醇化酶2(enolase 2，ENO2)在ccRCC中的表達情況及其與ccRCC的臨床分期、分級及預后的關系，為進一步研究ENO2在ccRCC中發生發展的分子作用機制提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org)中根據作者需求設定篩選和挖掘數據的條件。本研究中，①“Gene：ENO2”；②“Cancer Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma”；③“Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis”；④臨界值設定條件(Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%)作為篩選差異表達的條件。共篩選出腎透明細胞癌與正常腎組織的基因表達譜數據(6項研究7個子數據集)，ENO2在腎透明細胞癌組織和正常組織中存在顯著差異。然后我們在之前篩選的基礎上，選擇“Clinical Outcome：Survival Status”進行進一步篩選，最后根據Group By的下拉菜單選擇我們需要分析的腎透明細胞癌臨床因素，包括T分期、N分期、M分期、TNM總分期、5年生存時間。

1.2 實驗方法由于Oncomine數據庫非免費，我們先選擇需要的數據庫的柱狀圖，然后右擊鼠標，選擇“審查元素”，將map處的數據拷貝保存到data.txt文件中。然后利用R語言中的devtools和Oncomine包提取data.txt文件中的相關臨床數據，具體代碼如下：①library(devtools)；②install_github("yikeshu0611/Oncomine")；③library(Oncomine)；④a=Oncomine_bar("data.txt")；⑤head(a)；⑥write.table(a,"a.txt",sep=" ",quote=FALSE)，最后對新得到的a.txt文件中的數據進一步分析。

1.3 統計學方法所有數據采用SPSS 23進行統計學分析，兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用One-way ANOVA方法，預后分析采用Kaplan-Meier模型，以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ENO2在不同腫瘤中的表達情況Oncomine 數據庫中共收集了447項有關ENO2在腫瘤與正常對照之間比較的研究，有 42項有統計學差異，其中29項ENO2高表達，13項ENO2低表達。有7項腎癌相關的研究均表明ENO2表達升高(表 1)。

2.2 ENO2在腎透明細胞癌中的表達情況利用Oncomine數據庫進一步分析ENO2在腎透明細胞癌中的表達情況，發現自2003年起共有6項研究，7個腎透明細胞癌數據集涉及ENO2在腎透明細胞癌和正常組織中的表達，共包括1 126例標本。相關研究分別發表于Cancer Res[5]、Clin Cancer Res[6-7]、BMC Cancer[8-9]、TCGA。接著我們利用R語言分別提取Oncomine 數據庫中7個ENO2相關的腎透明細胞癌數據集的數據，并對ENO2在腫瘤與對照組的差異表達進行分析，結果顯示在 BEROUKHIM等[5]、GUMZ等[6]、JONES等[7]、LENBURG等[8]、YUSENKO等[9]、TCGA等6項研究7個數據集研究中，ENO2在腎透明細胞癌中均顯著高表達 (圖1，P<0.001)。

表1 Onconime 數據庫中ENO2在不同腫瘤中的表達

腫瘤類型研究數(癌癥vs.正常)ENO2高表達ENO2低表達腦及中樞神經系統腫瘤09宮頸癌30食管癌20腎癌70白血病22肺癌40淋巴瘤01黑色素瘤10肉瘤40胰腺癌20前列腺癌01其他腫瘤40顯著性差異的研究2913

圖1 Oncomine 數據庫中ENO2在不同腎透明細胞癌數據集中的表達

A：Beroukhim研究，癌癥組1為遺傳性ccRCC，癌癥組2為非遺傳性ccRCC；B：Gumz研究；C：Lenburg研究；D：Yusenko研究；E：Jones研究；F：TCGA數據庫。*P<0.001。

2.3 ENO2與腎透明細胞癌臨床分期分級及預后的關系為明確ENO2與腎透明細胞癌的臨床相關性，我們利用R語言提取Oncomine數據庫中ENO2基因表達與分期、分級及預后的數據，經分析發現ENO2基因的表達水平與腎透明細胞癌的分期和分級呈正相關，而與5年總生存時間呈負相關(圖 2)。

圖2 ENO2表達與ccRCC分期、分級及預后之間的關系

A：ENO2與ccRCC T分期之間的關系；B：ENO2與ccRCC N分期之間的關系；C：ENO2與ccRCC M分期之間的關系；D：ENO2與ccRCC TNM總分期之間的關系；E：ENO2與ccRCC 分級之間的關系；F：ENO2與ccRCC 5年總生存時間之間的關系。

3 討 論

ENO2，又稱神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，是一種含433個氨基酸的長鏈酸性二聚體蛋白，包括兩種烯醇化同工酶，γγ和αγ，主要分布在神經細胞、神經內分泌細胞及由此來源的腫瘤細胞[10]，但在紅細胞、血小板、乳腺組織、前列腺和子宮中也有少量表達[11]。它在糖酵解中起重要的作用，可促進β-甘油磷酸酯轉化為二羥磷酸丙酮。而糖酵解可通過提供腫瘤所需的能量從而顯著促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤的進展中起重要的作用[12-13]。

ENO2在多種腫瘤中過度表達，如胃癌[14]、前列腺癌[15]、膠質瘤[16]、肺癌[17]等。膠質瘤細胞在低氧和血清饑餓的情況下，ENO2表達顯著升高，而抑制其表達后可抑制腫瘤細胞的生長，證實在應激狀態下腫瘤細胞通過糖酵解維持腫瘤細胞的生長[16]。由此可見，通過抑制ENO2參與的糖酵解，可作為腫瘤治療的潛在靶點。同時研究發現，ENO2與腫瘤的轉移相關，ENO2的C末端的肽可通過RhoA激酶來調控肌動蛋白細胞骨架結構，參與膠質瘤細胞的轉移[16]。近幾年ENO2的研究主要集中在分子標志物的研究[18]，臨床上已用于肺癌等腫瘤的協助診斷。有研究發現，組織及血清中的ENO2水平在多種腫瘤中起著重要的作用，如在小細胞肺癌和非小細胞肺癌中ENO2可作為診斷、預后、隨訪及治療有效性的標志物[19-21]；在精原細胞瘤中可作為診斷的標志物；在類癌中可作為診斷、復發及治療有效性的標志物；在甲狀腺髓樣癌中可作為復發及治療有效性的標志物；在神經母細胞瘤中可作為診斷、預后、復發和治療有效性的標志物[12]。最近研究發現，血清中ENO2的水平與急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的免疫類型、風險分層和血清中乳酸脫氫酶含量密切相關。多因素分析發現ENO2高表達可作為成人ALL的獨立預后因素。進一步研究發現ALL患者接受化療后ENO2 mRNA表達水平降低，然而復發時表達顯著升高。ENO2 mRNA表達升高，可通過上調糖酵解相關基因的表達和促進Akt活性誘導細胞增殖、糖酵解和糖皮質激素耐受。因此，ENO2可作為ALL患者化療有效性及復發的標志物，為ALL的治療提供潛在的治療方案[22]。

那么ENO2是否與腎透明細胞癌相關，是否可作為腎透明細胞癌的診斷、預后、復發及治療有效性的標志物，目前尚不明確。為此，我們首先利用Oncomine數據庫挖掘ENO2基因在不同腫瘤組織中的表達情況，結果發現，在有統計學差異的42項研究中，有29項研究顯示ENO2在腫瘤中高表達，其中包括肺癌、腎癌、淋巴瘤、白血病等。隨后進一步分析了7個腎透明細胞癌數據集中1126例標本，發現ENO2在ccRCC中高表達，而且與ccRCC的分期分級及預后密切關系。研究結果顯示，ENO2的表達量越高，ccRCC分期分級越高，兩者密切相關，P<0.05；同時我們還發現ENO2表達高的患者，其總生存時間顯著降低。

綜上所述，我們通過Oncomine數據庫中的大樣本數據，發現ENO2在ccRCC組織中表達升高，且與ccRCC分期、分級及預后密切相關，為我們進一步深入研究腎透明細胞癌的發生發展機制、診斷預后標志物及靶向治療藥物提供可靠的理論依據，有利于我們深入研究ENO2在腎透明細胞癌中的作用機制。但是由于本研究主要基于Oncomine數據庫中的數據，不同的研究之間存在一定的差異性，而且有些研究的樣本量過小，分析得到的結果可能與實際結果有一定的差異性。因此，單純地利用Oncomine數據庫存在一定的缺陷和局限性，在未來的研究中我們將進一步在腎癌手術標本中驗證其表達及在細胞和動物實驗中探索ENO2的作用及調控機制。