四川省豬源蓋塔病毒的分離鑒定及遺傳進化分析

江朝源,李 飛,曾喻兵,彭珂楠,張儒博,杜佩珊,馮 宇,殷鑫歡,朱 玲,2,徐志文,2

蓋塔病毒(Getah virus)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員[1]。1955年Scherer等[2]首次在馬來西亞橡膠林中生存的白雪庫蚊(Culex gelidus)中分離得到該病毒,GETV可感染多種動物并引起馬和豬發病,其癥狀表現為發燒、蕁麻樣皮疹和后肢水腫[1],2017年10月周峰等[3]首次報道中國河南省某豬場感染蓋塔病毒。該病毒粒子呈球形,有囊膜及纖突,直徑約70 nm,單股正鏈RNA,病毒基因組全長約11～12 kp,編碼區包含2個獨立開放閱讀框ORF1和ORF2;ORF1長約7 407 bp,編碼4種非結構蛋白NSP1、NSP2、NSP3和NSP4;ORF2長約3 759 bp,編碼5個結構蛋白Cap、E3、E2、6K和E1。5′端含有非編碼區(5′UTR)和帽子結構,3′端含有非編碼區(3′UTR)和Poly(A)尾[3]。由于衣殼蛋白Cap基因全長804 bp,該基因高度保守、對病毒顆粒的形成和存活至關重要[4];NSP3基因全長約1 572 bp,變異頻繁[5],其C端參與病毒的復制[6],因此這2個基因常被分別用作該病毒的檢測、鑒定和變異分析。

本研究首次從中國四川省一豬場混合感染豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),臨床癥狀表現為震顫、皮膚發紅、精神頹廢、棕黃色腹瀉、關節炎的仔豬血液中檢測并分離到1株GETV,對該病毒進行全基因序列測定,分析該病毒分子生物學遺傳特征,對豬源GETV的感染譜和致病性、感染和傳播機制、環境微生物學及公共衛生等相關研究具有重要意義,并為之提供寶貴的研究素材。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料及細胞系 病料來源于四川省某發病豬場送檢的發病仔豬血液,BHK21細胞、PK-15細胞由本實驗室保存。

1.1.2 主要設備和試劑 RNAiso Plus來自寶日醫生物技術(北京)有限公司;DL2000 DNA Marker、反轉錄酶試劑盒、2×TaqPCR Master-Mix、Nuceanse-Free water和p MD19-Tsimple載體,來自大連寶生物工程有限公司;Trizol LSReagent、小量質粒DNA提取試劑盒和小量膠回收試劑盒,于北京博邁德生物技術有限公司購買。大腸桿菌DH5α由四川農業大學動物生物技術中心制備,DMEM為Gibco公司產品、胎牛血清為北京四季青公司產品。PCR儀、Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統購自Bio-Rad公司,恒溫水浴鍋、恒溫搖床購自Thermo Fisher公司;甲基纖維素、福爾馬林和結晶紫來自成都市科隆化學品有限公司。

1.1.3 檢測引物的設計與合成 參考GenBank上GETV M1株全基因[7](登錄號為:EU015061),生物工程(上海)公司利用Primer Premiers 5.0軟件針對Cap和NSP3部分序列設計2對特異性引物,見表1。

表1 擴增GETV Cap和NSP3基因部分序列的引物信息Tab.1 Primers for amplification of some sequences of Cap and NSP3 genes of GETV

1.2 方 法

1.2.1 病料樣品處理 取感染仔豬血樣1 mL,用含青、鏈霉素的DMEM作3∶1(V/W)稀釋。反復凍融3次后,3 000 r/min離心10 min,取上清保存到-80℃。

1.2.2 病毒分離鑒定 上清液經0.22μm濾器除菌,取0.2 mL接種到生長狀況良好的單層BHK21細胞上。37°C吸附1 h,棄上清,加入2 mL含2%FBS的DMEM維持液,37℃、5%CO2條件下培養。每天觀察記錄細胞病變(CPE),若有病變收取病毒培養物,于-80℃反復凍融3次,離心取上清接種BHK21細胞進行傳代培養。盲傳3代后進行蝕斑純化和RT-PCR檢測。將純化后有CPE且RT-PCR檢測為GETV陽性的培養物用BHK21細胞、PK15細胞傳代5次,收獲病毒置-70℃保存;無CPE者丟棄。

將BHK21細胞(約106個/mL)接入96孔板長成單層后,棄去培養基,用無菌PBS沖洗3次。將第5代細胞培養物10倍系列稀釋,各選取10-3～10-8共6個稀釋度,以每孔100μL接種BHK21細胞,每個稀釋度8個重復,同時設置陰性和陽性對照。37℃、5%CO2吸附1 h后,每孔補加100μL含2%FBS的DMEM維持液,觀察并記錄出現CPE孔數。試驗重復3次,運用Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.3 GETV核酸檢測 取300μL病毒液按照TrizolRNA提取試劑盒說明書提取病毒總RNA。反轉錄體系(10μL):dd H2O 4.5μL、5×Buffer 2.0 μL、反轉錄酶0.5μL、d NTP 0.5μL、隨機引物0.5 μL、模板2.0μL。反應條件為:35℃5 s、85℃15 min,cDNA模板用于PCR擴增。PCR體系(10 μL):2×TaqPCRmaster Mix 5.0μL、cDNA 1.0 μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、dd H2O 3.0 μL。反應擴增條件:Cap基因95℃預變性5 min;95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個循環,72℃延伸7 min;NSP3基因95℃預變性5 min;95℃變性30 s,56℃退火35 s,72℃延伸40 s,共35個循環,72℃延伸7 min擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳并進行凝膠成像觀察。

1.2.4 GETV全基因擴增與測序 全基因組序列參考HNNY-2株設計12對引物分段進行擴增,擴增的目的片段按DNA膠回收試劑盒說明書回收純化產物,與p MD18-T載體連接,轉化、篩選及PCR鑒定后,送至生工生物工程(上海)公司測序,12對引物序列見表2。

表2 擴增GETV全基因序列的引物信息Tab.2 Primers for amplification of all sequences of genes of GETV

1.2.5 GETV全基因序列分析 將測得的12個序列片段分別在NCBI數據庫中進行BLAST比對,利用DNA Star將所有測序片段及5′和3′進行拼接,與GenBank上具有代表性的GETV毒株對序列進行相似性分析;用 MEGA 5.0中的鄰接法進行遺傳進化分析、繪制系統進化樹。序列分析所用參考毒株見表3。

表3 國內外參考毒株Tab.3 Domestic and foreign reference strains

2 結 果

2.1 RT-PCR檢測 病料樣品、細胞培養物Cap、NSP3基因均為陽性。用GETV特異性Cap和NSP3基因引物對病料樣品和第3代BHK21細胞培養物進行RT-PCR擴增,能夠擴增出約316 bp、810 bp的預期單一目的片段(圖1)。

圖1 病料樣品和第3代細胞培養物Cap、NSP基因RT-PCR產物擴增凝膠電泳圖Fig.1 Gel-electrophoresis of disease material samples,Cap and NSP gene rt-pcr products of third-generation cell culture

2.2 分離到GETV 待測樣品接種到BHK21細胞連續傳代3次,經蝕斑純化獲得單個蝕斑克隆(圖2)。同對照組相比,該分離物感染BHK21細胞和PK15細胞后約12 h,細胞出現空洞;24 h后細胞明顯變圓,部分開始脫落;36 h后大量脫離,貼壁細胞大部分變圓(圖3)。

細胞培養物經RT-PCR鑒定,可擴增出GETV的特異性目的條帶,無PRRSV特異性目的條帶。分離物傳至第5代時用Reed-Muech氏法計算出細胞培養物的TCID50為106.85/0.1 mL將其分別命名為SC201807株。

圖2 SC201807株感染BHK21細胞后的病毒蝕斑圖Fig.2 Virus plaque of SC201807 strain infected with BHK21 cells

圖3 SC201807株感染BHK21細胞、PK-15細胞后產生的細胞病變,放大倍數為10×20Fig.3 Cell changes after infection of BHK21 cells and PK-15 cells by SC201807 strain,the magnification is 10×20

2.3 獲得SC201807毒株完整全基因組序列 利用12對特異性引物將SC201807基因組進行分段擴增,經回收、連接、轉化、克隆、測序、拼接后,獲得SC201801株全基因組序列,長度為11 691 bp。其堿基 T、C、A、G 占比例分別為19.7%、26.1%、28.0%和26.2%;GC含量為52.3%。基因組組成和開放性閱讀框(ORF)大小與GenBank中GETV基本一致,基因組主要包括:5′UTR、3′UTR以及位于兩者之間的兩個開放閱讀框,其中5′端起始的78個核苷酸和3′端最后403個核苷酸為非編碼區、5′端非編碼區之后的7 401個核苷酸編碼構4種非結構蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4),3′端非編碼區之前的3 759個核苷酸編碼5種結構蛋白(C、E3、E2、6K和E1),2個開放閱讀框之間有44個核苷酸為非編碼連接。SC201807株全基因序列已上傳至GenBank登錄號為MK693225。

2.4 GETV全基因組序列比對分析 對GETV全基因組核苷酸序列進行相似性分析,結果顯示SC201807與GenBank中上傳的35株GETV序列相似性為99.0%～96.1%,SC201807與中國河南省豬源毒株 HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1,中國吉林省蚊源毒株JL17/08、JL1707,河北省蚊源毒株HB0234以及日本蚊源毒株15-I-752、12IH26相似性最高為99.0%;與中國云南省蚊源毒株YN12031相似性最低為96.1%(圖4)。

圖4 SC201807株GETV與參考毒株全基因組核苷酸序列相似性(%)比較Fig.4 Comparison of nucleotide sequence similarity(%)between GETV strain and reference strain of SC201807

2.5 GETV E2蛋白氨基酸突變位點分析SC201807株E2序列的長度為1 266個核苷酸,在與36株GETV分離株E2蛋白氨基酸序列比對顯示,SC201807株E2氨基酸序列與中國豬源HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1,中國蚊源HB0234以及日本蚊源16-I-676、16-I-674、16-I-599、15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26株高度保守,僅在E310(天冬氨酸→谷氨酸)發生突變。SC201807株與MM2021原始株比較共有4個氨基酸差異,分別為E54(苯丙氨酸→異亮氨酸),E73(絡氨酸→組氨酸),E310(天冬氨酸→谷氨酸),E342(纈氨酸→異亮氨酸),見圖5。

圖5 SC201807株GETV與參考毒株E2蛋白氨基酸序列比對Fig.5 Comparison of amino acid sequences between GETV of SC201807 strain and E2 protein of reference strain

2.6 遺傳進化分析 基于全基因組核苷酸序列遺傳進化分析顯示可以將GETV劃分為4個主要進化群體,分別為1組M1株2008年中國海南分離所得,2組1956年日本分離到的GETV SAGV,3組2012年中國蚊蟲中分離到的YN12031株,4組主要包括日本蚊源和中國豬源中分離出來的所有毒株,SC201807株也屬于第4組,其與中國豬源HNJZS2及日本蚊源15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26親緣關系最近,處于同一進化分支,如圖6A。

通過E2推導的氨基酸序列遺傳進化分析結果顯示,可以根據E2大致劃分為2個組,2012年中國云南分離到的YN12031株和2000年俄羅斯分離到的LEIV 16275 Mag株處于同一進化分支為1組;其余所有毒株為2組,SC201807屬于2組與中國豬源HNJZ-S2及日本蚊源16-I-676、16-I-674、16-I-599、15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26親緣關系最近屬于同一分支,如圖6B。

圖6 SC201807株GETV與參考毒株全基因序列(A)及E2基因推導的氨基酸序列(B)進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences corresponding to the complete genome of isolate SC201807(A)and deduced amino acids sequences of E2gene(B)

3 討 論

1955年發現GETV至今,血清學檢測結果顯示,GETV廣泛分布在亞洲、大洋洲,在多種動物體內均能檢測到GETV抗體,因此被確定為重要的動物源性病原體[8]。盡管尚未有引起人類疾病的報道,但人的血清樣本中普遍能檢測到GETV病毒中和抗體,因此目前人們一般把該病看做人獸共患病[9]。

目前我國對GETV的研究主要局限于人群中血清流行病學調查和庫蚊體內病毒分離[10-12],至于蚊子體內的病毒從何而來以及動物在該病毒傳播過程中所起的作用尚不得而知,GenBank中收錄眾多的中國來源GETV毒株,包括大量蚊源和個別豬源、狐貍源及蠓源[13]毒株。近兩年來中國開始報道分離到豬源的GETV,由周峰等[3]于2017年報道分離到,并在山西、湖北、河南、安徽四省豬場中檢測出37份陽性樣本,同時2017年在湖南省豬群中發生了大規模GETV的感染,造成大量仔豬死亡,母豬流產并導致了重大經濟損失[19]。

研究GETV的來源、在我國的生態學分布、對動物和人的致病性、確定其終末宿主以及蚊子是否在人和動物間扮演媒介角色等均具有重要的公共衛生意義和動物生產應用價值。本研究從四川某豬場流產胎兒體內分離到首株GETV,不僅擴大其感染譜,也為GETV可以感染豬群引起臨床發病提供了充分證據,為今后深入開展其他相關研究提供了寶貴的研究素材,同時也為人群感染GETV的相關研究開辟了一片新領域。

我國作為世界養豬與豬肉消費第一大國,人們接觸生豬及其產品的機會甚多,因此,豬病流行動態與人類健康密切相關。蓋塔病毒屬于人獸共患病,本研究不僅為公共衛生安全提出新的警示,也向探明該病毒的傳播鏈條邁近了一步。另外值得注意的是,本研究是從混合感染豬繁殖與呼吸綜合征的仔豬血液中分離得到的GETV,在進行分離鑒定時首先選用BHK21細胞進行分離并純化,排除了PRRSV的干擾。在蔣正軍豬繁殖和呼吸障礙綜合征(PRRS)病毒囊膜糖蛋白(GP5)自身抗獨特型抗體的鑒定報道中指出,感染PRRSV后1～2月才出現中和抗體,這就導致感染PRRSV后一定時期內免疫缺陷[20],PRRSV是一種免疫缺陷病,感染后機體免疫系統損傷,會造成混合或繼發感染[14],推測本研究中的GETV和PRRSV混合感染可能是由于其免疫缺陷導致;而引起母豬流產的病毒種類甚多,包括日本腦炎病毒(JEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、PRRSV、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬圓環病毒3型(PCV3)豬細小病毒(PPV)和CSFV等。近年來病豬混合感染的概率不斷攀升,其中PRRSV和PCV均屬于免疫缺陷病,袁婧等[15]在報道中指出,PCV2與多種病原混合感染的現象十分普遍。推測GETV與這2種病毒的混合感染概率較高,王新港等[21]通過建立PRRSV與GETV的雙重RT-PCR對河南省136份臨床疑似PRRSV樣品進行檢測,共檢出PRRSV陽性樣品52份(38.2%),GETV陽性樣品15份(11.2%),結果也表明GETV與PRRSV混合感染比例較高;在周峰等[16]流行病學調查報道中也證實了此推測,雖然GETV與各個病原混合感染之間的機制尚不清楚,但在臨床研究中開展流行病學調查和建立混合感染檢測方法,并分析其流行病學特征十分有必要。

將SC201807與Gen Bank數據庫中現有的36株GETV全基因組核苷酸序列同源性比較發現,序列與近期公布的中國豬源毒株HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1以及日本蚊源毒株15-I-752、12IH26高度相似,即為99.0%,但與中國云南省蚊源毒株YN12031相似性最低為96.1%。通過對E2蛋白氨基酸序列突變位點分析發現GETV的結構蛋白E2基因高度保守[17],E2編碼的結構蛋白是病毒的抗原識別位點和中和位點,在吸附靶細胞、感染宿主以及誘發機體產生抗感染免疫中充當重要角色,SC201807株E2氨基酸位點與中國豬源HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1,中國蚊源HB0234以及日本蚊源16-I-676、16-I-674、16-I-599、15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26株高度保守,僅在E310(天冬氨酸→谷氨酸)發生突變,氨基酸的穩定性更有利于基于E2蛋白開發的疫苗上產生交叉保護性。通過對全基因組核苷酸序列和E2蛋白氨基酸序列繪制遺傳進化分析結果顯示,SC201807株與中國豬源HNJZ-S2及日本蚊源15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26親緣關系最近,處于同一進化分支;在李媛媛[17]的報道中將GETV大致劃分為4個主要進化群體,除原始株 MM2021、GETV SAGV、YN12031其余所有從中國,日本,韓國和蒙古在1964年至2014年從蚊子,豬,馬和其他動物中分離出來的所有毒株劃分為同一組群,根據本研究的遺傳進化分析中SC2101807株也屬于此組群,同時中國豬源與日本蚊源的核苷酸序列高度同源以及在遺傳進化中也處于同一分支表明中國豬源蓋塔的傳入與日本蚊源的相關性較大。

HiroshiBannai等[18]首次報道了2種不同動物馬群與豬群之間蓋他病毒感染與發病的地理空間和時間關系,表明2010-2015年期間豬群的蓋他病毒陽性率在不斷上升;而2014-2015年期間豬群與馬群的GETV感染具有同步性;從豬群和馬群分離的GETV其核苷酸全序列具有99.89%～99.94%的相似性。該研究結果提示上述2種家畜之間的GETV感染存在密切相關性,但究竟是什么因子在這種相關性中起媒介作用尚無確切證據。李媛媛等[22]對云南省家畜進行蓋塔病毒血清學調查,發現其在雞,鴨,奶牛,豬和肉牛的血清樣本中均檢測到GETV抗體,表明當地可能有大量的GETV宿主動物,媒介傳播造成多種動物之間感染機制也尚不清楚。目前已知GETV有較強的宿主性,侵害多種動物的胎兒和新生兒,臨床中重要的是監測GETV感染發生率,但因此如果只對正常人群進行血清學調查,而忽視對孕婦、產婦、新生兒及流產胎兒等重點對象進行深入研究,可能很難掌握該病毒對人類的真實危害程度。

盡管GETV進入人們視野已長達60余年,但對其危害及影響程度尚未清楚,隨著各種相關研究的不斷深入,相信人們將會對GETV具有更全面的了解和認識,從而為防治提出科學依據。

利益沖突:無

引用本文格式:江朝源,李飛,曾喻兵,等.四川省豬源蓋塔病毒的分離鑒定及遺傳進化分析[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):805-814.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.112