MAPK通路主要激酶抑制劑對亞洲帶絳蟲感染乳豬肝細胞生長抑制率和凋亡率的影響

門萬琪,楊漢蕾,張 科,楊 林,許士剛,牟 榮

亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)是一種常見的人獸共患寄生蟲,人是唯一終宿主[1]。這種帶絳蟲主要分布在亞太部分地區[2],近年還在印度北部地區和老撾發現該蟲種[3-4]。亞洲帶絳蟲的流行與當地人們不良的飲食和生活習慣有關,而它的感染則直接危害人和家畜的健康[5]。亞洲帶絳蟲的最適宜中間宿主是豬,囊尾蚴一般寄生于肝臟,導致肝組織的病理變化。前期研究發現囊尾蚴的寄生可以引起肝臟的急慢性炎癥反應、肝細胞凋亡及肉芽腫形成等多種病理變化[6]。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物體內重要的信號轉導系統之一。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal protein kinase,JNK)和p38MAPK,MAPK通路對細胞增殖,細胞分裂及分化,應激和炎癥反應等產生重要作用[7]。MAPK信號通路在寄生蟲感染宿主過程中參與宿主細胞對有絲分裂原、熱休克蛋白和促炎細胞因子等多種刺激的反應,還參與調節細胞增殖,基因表達,細胞存活和凋亡等功能[8]。近年來,課題組相關研究發現,亞洲帶絳蟲感染乳豬后可顯著影響肝細胞MAPK通路主要激酶基因的表達并抑制肝細胞生長[9]。另外,Lin R等[10]在研究感染多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis)的小鼠肝臟基因表達譜后發現MAPK信號通路主要激酶基因均出現上調表達并影響肝細胞的增殖。

目前用CCK-8法和流式細胞術對寄生蟲感染宿主組織細胞的損傷作用進行研究。常見的ERK、p38和JNK抑制劑分別是U0126、SB203580和SP600125。Smout MJ等[11]研究發現U0126可以抑制華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)分泌蛋白所致小鼠成纖維細胞增殖。Jin X等[12]研究發現SB203580可以抑制犬新孢子蟲(Neospora caninum)對牛腎細胞的侵襲作用。Wu Y等[13]研究華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)分泌蛋白可激活肝形狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC),而SP600125能抑制JNK活性,抑制HSC過度增殖。但目前尚無U0126、SB203580和SP600125對亞洲帶絳蟲感染中間宿主乳豬肝細胞MAPK通路影響的研究報道。本研究在建立亞洲帶絳蟲感染和MAPK特異性抑制劑干預的動物模型基礎上,分別采用CCK-8法、流式細胞術和RT-PCR檢測肝細胞生長抑制率、細胞凋亡率以及ERK1、p38和JNK1基因的表達水平,以了解MAPK特異性抑制劑干預后感染肝細胞MAPK信號通路相關基因表達、細胞活力和細胞凋亡的變化,探究MAPK特異性抑制劑是否能夠減輕亞洲帶絳蟲所致乳豬肝組織損傷,進一步為抗囊尾蚴病的藥物研發及囊尾蚴病的治療提供新的、有價值的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蟲體來源 亞洲帶絳蟲標本采自貴州省都勻市墨沖鎮。對近期有排節片患者用檳榔-南瓜子法驅蟲,經形態學觀察和分子生物學鑒定,確定采集蟲體為亞洲帶絳蟲并收集成蟲孕節和蟲卵。

1.1.2 實驗動物 30頭20 d齡約克二元施格雜交乳豬,動物批號[2017-151],體重3.4～7.5 kg,體健,經糞檢和間接血凝集試驗證實無豬囊蟲等寄生蟲感染,購自貴州省龍里縣種豬養殖基地。

1.1.3 主要試劑和儀器 Trizol試劑購自美國sigma公司,熒光定量PCR試劑盒和和cDNA合成試劑盒購自日本TAKARA公司,氯仿、異丙醇和乙醇均購自上海國藥集團,cck一8試劑購自北京康為世紀公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR儀(7300)為美國ABI公司產品,酶標儀(μ一Quant)為美國Bio—Tek公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 蟲卵收集和計數 取每條亞洲帶絳蟲成蟲后部10～20節孕節,在盛有生理鹽水的培養皿中以細針沿縱軸劃破孕節使蟲卵溢出,并反復用生理鹽水清洗,裝入試管以2 000 r/min離心20 min,收集蟲卵備用。光學顯微鏡下觀察收集的蟲卵并分別計數5次,取平均值,定量1 mL生理鹽水中蟲卵數為15萬個備用。

1.2.2 實驗動物感染和標本采集 乳豬隨機分為5組,即正常對照組4頭、實驗組5頭、U0126抑制劑干預組、SB203580抑制劑干預組和SP600125抑制劑干預組各7頭,實驗組以定量蟲卵15萬個/頭通過胃管灌胃感染。上述3組抑制劑干預組自灌胃之日起每頭乳豬分別腹腔注射抑制劑U0126、SP600125、SB203580 1 mg/kg,隔天1次,連續注射7次。各組在封閉環境下同條件飼養。于感染后第15 d麻醉處死所有組乳豬,采集對照組、實驗組和各抑制劑干預組乳豬肝組織,并剝除實驗組囊尾蚴。將各組肝組織放入冷凍管或有1 mL Trizol的EP管中,保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 CCK-8法檢測乳豬肝細胞生長抑制率 將-80℃冰箱取出的肝組織先用1640培養液沖洗后置于平皿中,再用注射器針頭輕輕研磨,邊研磨邊以1640培養液沖洗,直至組織研磨完全。收集肝組織細胞懸液,經300目尼龍網過濾,1 500 r/min離心5 min,再以1640培養液重懸細胞。調整各組肝細胞懸液濃度為5 000個/mL,以每孔100μL細胞懸液量接種于96孔板,每孔再加入10μL CCK-8,于37℃、5%CO2的條件下培養2 h后,在450 nm波長處讀取光密度值。以對照組作為陰性對照,按公式計算實驗組和各抑制劑干預組肝細胞生長抑制率:細胞生長抑制率＝(1-實驗組OD值/陰性對照組OD值)×100%。對照組、實驗組和各抑制劑干預組各選取3個樣本檢測,每個樣本各做6孔。

1.2.4 流式細胞儀測定乳豬肝細胞凋亡率 取各組肝細胞懸液,每組肝細胞5×104個,1 000 r/min離心5 min,再用500μL AnnexinⅤ-FITC結合液重懸細胞,然后加入15μL Annexin V-FITC,4℃避光孵育15 min。加入5μL PI染液5 min后,上機檢測并分析細胞凋亡率。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測 根據GenBank相關序列,使用上海生工公司在線軟件設計ERKl、JNKl、p38和β肌動蛋白(β-actin)實時熒光定量PCR引物,并由其合成(表1)。采用Trizol一步法提取各組乳豬肝組織總RNA,按試劑盒說明操作獲得逆轉錄cDNA。PCR反應條件:95℃預變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火34 s,72℃延伸30 s,共40個循環。記錄熒光定量PCR儀得出的各組目的基因和內參基因的CT值,重復3次取平均值。計算目的基因的△△CT值,采用2-△△CT法計算出各組目的基因的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for Quantitative Real-Time PCR

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析處。1)數據的正態性分析。2)實驗數據以±s表示,采用單因素方差分析比較各組間差異,組間兩兩比較視方差齊性采用LSD法(齊),P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 亞洲帶絳蟲蟲卵實驗感染乳豬結果 感染后第15 d,實驗組肝臟和各抑制劑干預組肝臟均可見白色細小點狀結構,未見清晰囊尾蚴結構(圖1)。實驗總共感染乳豬26頭,其中感染組5頭,3種抑制劑干預組21頭。乳豬囊尾蚴感染率為100%。

圖1 亞洲帶絳蟲感染后不同組乳豬肝臟外觀,箭頭所示為囊尾蚴Fig.1 Liver appearance of different groups of porkets after infection with Taenia asiatica,↑indicated cysticercus

2.2 CCK-8法測乳豬肝細胞的生長抑制率 感染組肝細胞生長抑制率為(23.11±1.26)%,U0126組生長抑制率為(16.48±0.7)%,與感染組相比(t＝9.223,P＜0.001);SB203580組生長抑制率為(12.59±1.2)%,與感染組相比(t＝11.532,P＜0.001);SP600125組生長抑制率為(18.3±0.75)%,與感染組相比 (t＝6.775,P＜0.001);各干預組均較感染組的生長抑制率明顯降低(圖2)。

圖2 感染組和抑制劑干預組乳豬肝細胞的生長抑制率(±s)%Fig.2 Growth inhibition rate of hepatocytes in infection group and inhibitor intervention group(±s)%

2.3 流式細胞儀檢測乳豬肝細胞凋亡率 流式細胞儀的細胞點圖示:流式細胞分析圖的左下區(LL)為正?；罴毎?右下區(RL)為早期凋亡細胞;右上區(RU)為晚期凋亡或死亡細胞,左上區(LU)為收集過程中損傷的細胞(圖3)。對照組肝細胞凋亡率為(13.44±1.6)%,感染組(18.21±1.1)%與對照組相比(t＝-4.282,P＜0.05);U0126組為(26.12±3.3)%,與對照組相比 (t＝-5.998,P＜0.01),差異有統計學意義;與對照組相比,SB203580組為(15.34±1.4)%(t＝-1.548,P＞0.05),SP600125組為(16.22±2.7)%(t＝-1.545,P＞0.05),此兩組的肝細胞凋亡率與對照組無統計學差異;與感染組相比,U0126干預組的肝細胞凋亡率增高,差異有統計學意(t＝-5.934,P＜0.001),SB203580干預組的肝細胞凋亡率較感染組降低,差異有統計學意義(t＝3.821,P＜0.01),SP600125干預組的肝細胞凋亡率較感染組相比,差異無統計學意義(t＝1.188,P＞0.05)(圖4)。

2.4 實時熒光定量PCR檢測乳豬肝細胞ERK1、p38、JNK1的mRNA相對表達量的變化 與對照組相比,感染組(t＝-10.739,P＜0.05)和 U0126干預組(t＝-4.157,P＜0.05)的 ERK1 mRNA 相對表達量增高,差異有統計學意義;與感染組相比,U0126干預組ERK1 mRNA相對表達量降低,差異有統計學意義(t＝3.462,P＜0.05);與對照組相比,感染組(t＝-8.227,P＜0.01)和SB203580干預組(t＝-3.118,P＜0.01)p38 mRNA相對表達量增高,差異有統計學意義;與感染組相比,SB203580干預組p38 mRNA相對表達量降低,差異有統計學意義(t＝3.267,P＜0.05);與對照組相比,感染組(t＝2,887,P＜0.05)和SP600125干預組(t＝10.392,P＜0.05)JNK1 mRNA的相對表達量降低,差異有統計學意義;與感染組相比,SP600125干預組JNK1 mRNA的表達量降低,差異有統計學意義(t＝3.363,P＜0.001)(圖5)。

圖3 乳豬肝細胞流式檢測圖Fig.3 Flow cytometry figure of porcine hepatocytes

圖4 對照組、感染組和三種抑制劑干預組乳豬肝細胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of liver cells of suckling pigs in control group,infection group and three inhibitor intervention groups

3 討 論

寄生蟲的感染可影響宿主組織細胞MAPK通路中相關基因的表達導致該通路的激活并產生相應的生物學效應。Han S等[14]研究認為大鼠肝細胞炎癥和凋亡與華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)感染激活肝細胞MAPK信號通路有關。課題組前期研究也發現亞洲帶絳蟲幼蟲在乳豬體內發育過程中可影響肝臟MAPK通路中ERK1/2、p38和JNK1基因的表達水平[9]。有研究表明,通過抑制MAPK通路ERK1/2、p38和JNK1基因表達,能夠減輕陰道毛滴蟲感染導致的炎癥反應[15]。MAPK信號通路特異性抑制劑可抑制相應通路的激活,減輕寄生蟲感染后MAPK信號通路活化而產生的各種組織細胞病理損傷[11-13]。常見的MAPK信號通路抑制劑有 ERK 抑制劑(U0126)、p38MAPK 抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)等,這些抑制劑可作用于MAPK通路的相應位點,從而抑制通路激活,可能具有治療某些癌癥的潛力[16-17]。

圖5 感染組和U0126干預組ERK1基因、SB203580干預組p38基因、SP600125干預組JNK1基因mRNA相對表達量Fig.5 Relative expression of ERK1,p38 and JNK1 mRNA in infection group and three inhibitor intervention groups

研究表明肝臟內寄生蟲可通過激活MAPK通路來抑制肝細胞生長。Liu P等[18]發現日本血吸蟲卵抗原可激活小鼠肝細胞MAPK通路中p38和JNK蛋白激酶并抑制肝星狀細胞增殖。我們前期研究也發現亞洲帶絳蟲感染可通過改變MAPK通路中ERK1、p38和JNK基因表達來抑制肝細胞生長[9]。本研究使用3種抑制劑(U0126、SB203580和SP600125)對亞洲帶絳蟲感染乳豬進行注射干預,結果顯示3種抑制劑干預組的乳豬肝細胞生長抑制率均較感染組明顯降低。由此可見,經3種抑制劑干預,亞洲帶絳蟲幼蟲寄生所致的乳豬肝細胞生長抑制率明顯減低,有利于肝細胞生長。這可能與乳豬肝細胞中激活的MAPK通路被抑制有關,經特異性抑制劑阻斷后,肝細胞中MAPK信號通路相關基因的表達被抑制,從而影響了細胞的生長、增殖和凋亡。

此外,研究表明MAPK信號通路抑制劑可以影響寄生蟲的生長發育和寄生蟲對宿主的侵襲力。Cheng Z等[19]在研究U0126對多房棘球絳蟲(E-chinococcus multilocularis)泡球蚴生發細胞的作用中發現U0126抑制了蟲體生發細胞的增殖和生長。本實驗發現U0126明顯降低乳豬肝細胞生長抑制率,從而促進乳豬肝細胞生長,推測可能與亞洲帶絳蟲幼蟲在乳豬肝臟內生長發育中也受到U0126抑制有關。由于U0126可能抑制亞洲帶絳蟲幼蟲體內MAPK信號通路中主要參與細胞增殖、分化、轉錄調節和發育等過程的ERK1/2途徑,該途徑的激活受到抑制可能會干擾幼蟲在乳豬肝臟內的生長發育進程,以減輕幼蟲對肝組織的破壞和損傷,進而減緩肝細胞的生長抑制,具體機制尚有待進一步研究。另外,Jin X等[12]研究發現SB203580可顯著降低犬新孢子蟲(Neospora caninum)自身的運動能力和對牛腎細胞的侵襲作用。Bussière FI等[20]比較3種MAPK通路抑制劑(PD98059,SP600125和SB203580)在柔嫩艾美球蟲(Eimeria tenella)對宿主腸道上皮細胞侵襲性的影響研究中發現,SP600125和SB203580能顯著抑制該蟲對腸上皮細胞的侵襲力。由此我們推測,本實驗中SB203580和SP600125也可能通過降低亞洲帶絳蟲幼蟲在乳豬體內的活動能力或者抑制其對乳豬肝臟的侵襲作用,以減輕幼蟲對肝臟組織細胞的破壞,從而減少肝細胞損傷,使得肝細胞的生長抑制率降低,促進肝細胞生長。

MAPK信號通路是細胞凋亡過程中的關鍵參與者,但通路中不同級聯的激活對細胞凋亡的調節有所差異。研究表明MAPK信號通路中ERK基因的上調表達,ERK途徑激活可以促使細胞存活、減少細胞凋亡[21]。而MAPK信號通路中p38和JNK途徑的激活則促進細胞凋亡[22]。課題組前期研究結果顯示,亞洲帶絳蟲幼蟲感染乳豬肝臟后可致乳豬肝細胞凋亡增加[6]。Tsai JJ等[23]研究發現瑞格列尼(regorafenib)通過抑制SK-HEP-1細胞中的ERK和NF-κB途徑而促進細胞凋亡,表明抑制MAPK信號通路中的ERK途徑可以增加SKHEP-1細胞凋亡。Aoki Mdel P等[24]研究克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)感染的小鼠心肌細胞發現,抑制ERK1/2途徑可增加心肌細胞凋亡率。本研究發現,U0126抑制劑干預組的肝細胞凋亡率較對照組和感染組均明顯升高且ERK1 mRNA表達水平降低。由此推測,U0126抑制劑干預組乳豬肝細胞期凋亡增加可能與ERK1/2途徑的抑制有關,U0126可能通過下調乳豬肝細胞ERK1 mRNA表達水平來抑制ERK途徑,導致乳豬肝細胞凋亡率增加。

另外,研究表明有些原蟲可通過抑制JNK或p38 MAPK途徑來減少宿主細胞的凋亡率。Rodríguez-González J等[25]在墨西哥利什曼原蟲(Leishmania mexicana)無鞭毛體感染樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)的研究中發現無鞭毛體通過減少p38 MAPK和JNK的磷酸化,抑制被感染DC細胞的凋亡,以延長DC的存活。Chang JH等[26]研究證明SB203580的干預治療可持續阻斷陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)導致的人巨噬細胞凋亡。Sreekanth GP等[27]研究登革熱病毒(DENV)感染BALB/c小鼠肝臟發現,SP600125可抑制JNK1/2磷酸化,減少細胞凋亡,減輕肝損傷。本實驗發現,SB203580與SP600125干預組乳豬肝細胞p38和JNK1 mRNA表達水平降低,且肝細胞凋亡率較感染組明顯降低并且與對照組比較差異無統計學意義,說明SB203580與SP600125可明顯減少因亞洲帶絳蟲幼蟲感染所致的肝細胞凋亡。我們推測SB203580和SP600125可能通過下調p38和JNK1 mRNA表達來抑制p38和JNK途徑,以減少肝細胞凋亡的發生。

綜上所述,本實驗發現亞洲帶絳蟲感染可明顯影響乳豬肝細胞ERK1、p38和JNK1基因mRNA水平,特異性抑制劑可以通過改變乳豬肝細胞MAPK相關基因的mRNA水平減輕肝細胞的生長抑制和細胞凋亡,而在亞洲帶絳蟲感染乳豬肝臟的病理生理變化過程中,抑制劑是如何通過抑制不同底物磷酸化以及是否同時調節通路中其他相關基因的表達值得進一步研究。

利益沖突:無

引用本文格式:門萬琪,楊漢蕾,張科,等.MAPK通路主要激酶抑制劑對亞洲帶絳蟲感乳豬肝細胞生長抑制率和凋亡率的影響[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):797-804.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.084